The non-radiative relaxation mechanism of the newly synthesized hybridized-sensitive DNA probe has not been fully understood until now. In this study, the transient dark state of the probe, which is a double fluorescent dye attached to a specific DNA sequence, was investigated using a fluorescence spectroscopy. We showed that radiationless deactivation of the singlet excited state of fluorophores is mainly determined by photo-induced isomerization of the methine bridge by using absorption and fluorescence spectrum results. Radiationless deactivation of the fluorophores is sensitive to the factors that influence the rotation of methine bridge. Experiments done using solutes of differing molecular weight (sucrose, glucose and glycerine) to provide solutions of similar viscosity reveals the importance of solution viscosity and fluorophore conformation on radiationless deactivation. The quantum yield of the fluorophore in high viscous solutions can be explained by a simple diffusion model. This linear relationship is broken when a dimer conformation of the fluorophore starts to form, which in turn influences the emission intensity of the fluorophore. Based on the fluorescence-correlation results, a simplified two energy state model of the probe was constructed and this model provides an insight into the non-radiative relaxation mechanism of the fluorophore and the applications for DNA and RNA detection. The transient dark state was measured in various solvents that are known to affect the intersystem crossing or photoisomerization of the DNA probe. The transient dark state that was measured in a time scale of a few μs is a triplet state and is related to photoisomerization, viscosity, oxygen concentration, and hybridization, all of which are important parameters for cellular microscopy. The transient dark state in a time scale of a sub μs is sensitively changed after addition of target DNA. We can improve the probe’s capability to identify target DNA/RNA by using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) since the triplet state occurred after hybridization is distinctive in time scale with that occurred before hybridization.
측정하고자 하는 특정 DNA나 RNA에 선택적으로 결합하는 프로브의 광화학적, 광물리학적 특성을 형광분광법을 이용하여 분석하였다. 프로브 가운데 위치에 두 개의 cyanine dye가 서로 인접하여 결합되어 있으며, 해당 형광체는 hydrophobic interaction을 통해 주변 분자와 상호작용을 하며, 형광체와 DNA 염기간 상호작용은 형광세기와 관련해 특히 중요하다. 표적 분자와 결합하지 않은 경우, 두 형광체는 물에서monomer 또는 dimer 형태로 존재한다. 표적 분자가 존재하는 경우 프로브와 표적 분자간 상보결합이 이루어지면서, 각 형광체가 표적 분자 두 염기 사이에 intercalation된다. 이때 두 형광체는 서로 분리되어 monomer 형태로만 존재하게 된다. 용매의 유전율이 작아지면, 두 형광체 간의 hydrophobic interaction이 방해되어, 형광체는 주로 monomer형태로 존재하게 된다. Glycerine, glucose, sucrose, methanol, DMSO 등 다양한 유기물을 물에 녹인 용매로 형광과 흡광 스펙트럼을 측정하였으며 이를 통해, 해당 형광체의 양자수율이 주로 점성과 형광체의 형태에 따라 변화함을 확인할 수 있었다. 형광체의 형태변화는 분자의 excitonic 모델에 근거한 흡광 스펙트럼 해석을 통해 가장 잘 설명된다. 형광체의 비발광전이의 주요 경로가 광유도 이성질체화 반응임을 확인할 수 있었으며 점성이 비슷한 용매에서는 형광체의 구조에 의한 변화가 중요한 역할을 하는데, 이 부분은 H-aggregate의 dimeric quenching으로도 설명이 가능하다. 광유도 이성질체화 반응은 methin bridge의 회전에 필요한 활성화에너지의 크기가 낮은 경우에 쉽게 나타난다. 이는 본 논문에서 조사한 것과 같은 짧은 methine bridge를 가진 cyanine 형광체(thiazole orange or 2,2`-Methylenebis(N-alkylbenzothiazole))의 비발광전이 경로가 주로 광유도 이성질체화 반응이라는 점은 기존의 연구결과들과 잘 일치한다 말할 수 있다. Cynaine 형광체의 여기 전자의 Intersystem 전이는 일반적인 조건에서 매우 천천히 일어나는 반응이며, KI를 넣거나 목표 DNA와 반응을 시킨 경우에도 일반적인 형광, 흡광 분광계로는 triplet state에 대한 존재를 확인할 수는 없었다. 형광 상관함수 분광법 (Fluorescence Correlation Spectroscopy)을 통해 micro-second lag time 영역에서 과도적 암상태 (transient dark state)가 존재함을 확인할 수 있었다. 해당 암상태는 KI의 농도가 증가하면서 급격히 감소하는데, 이는 iodide 이온에 의한 triplet state의 quenching으로 이해할 수 있다. 또한 암상태는 용매의 점성이 증가하면 fraction과 relaxation time이 동시에 증가하는데, 이 역시 triplet state로 설명이 가능하다. 용매에 녹아있는 산소분자에 의해 triplet state이 diffusion-controlled quenching되기 때문이다. 암상태는 타겟 분자와의 결합 후에 급격한 변화를 보여준다. 암상태의 fraction이 타겟 분자의 농도 증가에 따라 크게 증가하며, relaxation time은 감소하는 경향을 보인다. 이때 암상태는 multi-exponential 함수로 피팅되며, 그 원인은 아직 분명하지 않다. 다만, 해당 암상태를 세포내 미세환경의 변화를 측정하는 지시자(indicator)나, 타겟 분자의 존재를 정량하는 새로운 도구로 활용할 수 있을 것이다. 기존에 연구된 isomerization에 의한 과도적 암상태는 isomerization반응과 back-isomerization반응이 점성의 변화나 혼성화 반응 등에 의해 동일한 변화를 겪기 때문에 population에 있어 비교적 작은 변화만을 보였었다. 하지만, intersystem crossing에 의한 과도적 암상태는 effective intersystem crossing 만이 isomerization에 영향을 받고 triplet deactivation은 상대적으로 isomerization에 직접적 영향을 받지 않기 때문에 주변환경 변화에 민감한 반응을 보이는 것으로 생각된다.
