In biomedical fields, the optical fluorescence microscopy is an attractive imaging technique for non-invasive in vivo studies. Confocal microscopy (CM) has the optical sectioning ability that can image thin sections of a thick tissue with sub-micron spatial resolution. The design for CM to deliver performance close to the diffraction limit is highly optimized. However, the performance of CM is degraded when imaging depth is going deeper from the surface. A biological specimen has a highly scattering media and a variation in refractive index due to its heterogeneous structures from macroscopic to microscopic scales. These two phenomena introduce the detrimental effects on imaging quality
A large number of scattering and absorption events restrict the propagation of photons to desired plane in biological sample. Recently a novel technique called FMM (focal modulation microscopy) is developed. FMM improves the penetration depth up to several hundreds of micrometers while maintaining diffraction limited spatial resolution. The excitation beam from continuous laser can generate intensity modulation signal only in focal plane of objective: this is called focal modulation. Focal modulation enables to distinguish desired signal with modulation and out of focus signal with non-modulation. Using the extracted modulation component from detection signal is effective technique to suppress the out-of focus signal.
In this paper, the high speed FMM is proposed. For enhancement of modulation speed, beat phenomenon by two AOMs has been used in the field of heterodyne interferometer. Two AOMs driven at slightly different radio frequencies (RF) generate two spatially separated beams with different optical frequencies. They are maintained in parallel non-overlapping manner before reaching the focal plane. In the focal volume, two beams interfere and generate beating signals resulting from the heterodyne interference. Finally the modulation frequency is difference between RF frequencies of AOMs. The method using AOMs achieves modulation frequency up to a few hundred MHz, significantly increasing imaging speed.
While with the effective background rejection, the specimen induced aberrations still exist and degrade the image quality. The distribution of the refractive index in the obstructing layers above the focal region introduces aberrations. In microscopy, aberrations lead to reduced resolution and lower signal levels. Previous studies for aberration correction to restore the imaging quality have reported. Deformable mirror (DM) and liquid crystal spatial light modulator (SLM) are used to change wavefront as adaptive optics. To apply the adaptive optics, wavefront sensing is very important process. Several types of wavefront sensing technique have been developed. The well-known methods are the Shack-Hartmann sensor and interferometric sensor. In fluorescence microscopy, wavefront sensors are not suitable because the phase properties of the excitation wavefront are lost by incoherent process. Therefore most of adaptive fluorescence microscope systems have used indirect methods for aberration measurement. The maximization of the photodetector signal is general goal of indirect approach. The Stochastic method to find maximum state tends to require a large number of iterations and has risk of photo bleaching.
In 2007, a model-based method based on modal wavefront sensing applied to CM was reported. By using the optimization function from modeling based on transfer function of optical system, fewer measurements are required to correct aberrations. And then microscope systems with a model-based method show better performance than model-free methods. This method is called image based adaptive optics because the specific properties extracted from images are used to maximize the value of optimization function.
Since the specimen-induced aberration can be expressed as phase aberration of pupil function, we have studied the OTF which is the autocorrelation of the effective pupil function. The derived MTF is the maximum value when there are no aberrations in pupil. Therefore the MTF becomes the foundation of metric function and appears in the spectral density of image. We defined a function enables to express the extent of aberrations from image. The image-quality metric function is defined as summation of total magnitude of spectral density of image and modeled as quadratic form with respect to coefficient of aberration mode.
The implementation of focal modulation microscopy with image-based aberration correction and analysis of the experimental results are performed. The intensity profile is fundamental tool to compare the contrast between two images. We can compare the intensity profile of CM, FMM and FMM with aberration correction experimentally. From the experimental results for the comparison of intensity profile, the image of FMM shows better contrast image by effective background rejection. And image of FMM with aberration correction shows more enhanced signal than FMM without aberration correction. Consequentially the contrast of FMM with correction is better than FMM. Therefore by using the FMM with aberration correction, we can get the high contrast image based on effective background rejection and signal enhancement in deep region from the surface of specimen. Finally we can perform the deep imaging in turbid media.
In conclusion, the fluorescence focal modulation microscopy with model based aberration correction has a capability of a high contrast imaging, deep imaging and fast correction of aberration. Experimental results verify that. Also the analysis and experimental result on the effects of aberrations tell us that the focal modulation microscopy with adaptive optics for aberration correction can prevent the degradation caused by the optical elements and specimen. The fluorescence focal modulation microscopy with model based aberration correction is expected to be used for deep imaging based on high contrast and fast aberration correction.
생의학 분야에서 광학 형광 현미경은 비침습 in-vivo 연구가 가능하여 매우 유용한 영상 획득 도구로 사용되고 있다. 특히 공초점 현미경은 마이크로 미터 이하의 높은 분해능을 가지는 광학 절편을 얻을 수 있어서 3차원 영상 획득이 가능하다. 회절 한계의 성능을 가지는 공초점 현미경의 설계기술은 매우 최적화 되어있다. 하지만 생체시편의 표면으로부터 깊이 있는 영상을 얻게 될 때, 공초점 현미경의 성능은 급격하게 저하된다. 이러한 이유는 시편으로부터 발생되는 산란과 다양한 굴절률 분포를 가지는 시편의 구조적 특징 때문이다.
생체 시편 내에서 수 많은 산란과정과 광학적 흡수과정은 표적 위치로의 광자의 진행을 방해하게 된다. 따라서 증가되는 후방산란이 실제 신호를 덮어버리게 되어서 영상의 명암과 분해능을 저하시키게 된다. 이를 극복하기 위해서 이광자 현미경이 개발되었다. 이광자 현미경은 초고속 광원을 이용하여서 수백 마이크로 미터의 투과 깊이에 있는 시편의 영상을 얻을 수 있다. 초고속 광원의 장파장 빛은 산란이 훨씬 적게 일어나기 때문이다. 하지만 이광자 현미경은 장파장을 사용하기 때문에 공간 분해능이 공초점 현미경에 비해서 낮고, 고가의 초고속 광원이 문제가 된다.
최근에 회절 한계의 공간 분해능을 유지하고 고가의 초고속 광원을 사용하지 않으면서 수백 마이크로 미터의 투과 깊이를 달성할 수 있는 초점 변조 현미경 (Focal modulation microscopy)가 개발되었다. 연속 발진형 레이저에서 나온 여기 빔이 오직 초점에서만 강도가 변조되게 만드는 것을 초점 변조라 부른다. 초점 변조는 초점에서 나오는 형광 신호만 변조시키기고, 초점 이외에서 발생되는 형광 신호는 변조되지 않는다. 따라서 검출되는 형광 신호에서 변조되는 신호만 추출하게 되면 효과적으로 초점 이외에서 발생되는 형광 신호를 차단할 수 있는 것이다.
기존 문헌에서 보고된 초점 변조 현미경의 경우 변조 속도가 너무 느려서 실시간 영상획득이 어렵다는 단점이 있었다. 따라서 본 논문에서는 두 개의 음향 광학 변조기 (acousto-optic modulator)을 이용하여 초점에서만 광학적 맥놀이 (beat)가 일어나게 설계하였다. 따라서 음향 광학 변조기를 이용하여 서로 다른 광학적 주기를 가지는 두 개의 빔을 만들어 내고, 초점에 이르기 전까지 두 빔을 서로 평행하게 진행하게 만든다. 그리고 초점 평면에서 두 빔이 만나게 되면 광학적 맥놀이가 일어나게 되는 것이다. 이 방식은 주로 헤테로다인 (heterodyne) 간섭계에서 사용된 방식인데, 본 논문에서는 초점 변조를 위해서 사용하였다. 결론적으로 이 방식을 이용하게 되면 수 백 MHz까지의 변조 속도를 얻을 수 있게 된다.
시편에서 유발되는 수차는 초점 변조 현미경의 성능을 저하시킨다. 초점에 도달하기 전의 영역에 존재하는 모든 시편의 구조에 의한 굴절률 분포들은 수차를 유발시킨다. 일반적으로 형광 현미경의 경우 수차에 의해서 영상의 분해능, 신호 대비 잡음비 그리고 영상의 명암 대비 등이 저하게 된다. 본 논문에서는 수차 보정을 위해서 영상 기반 수차 보정법을 사용하였다. 영상 기반 수차 보정 법의 장점은 각 수차 모드에 대한 영상 값을 모델링 할 수 있기 때문에 기존의 시행착오 방식으로 수차 보정하던 방식에 비해서 측정횟수가 매우 줄어든다 것이다.
시편에서 유발되는 광학적인 수차들은 동공 함수 상에 위상의 함수로 표현할 수 있다. 광학적 전달 함수는 동공 함수의 자기 상관 함수로 나타나며, 이를 이용하여 변조 전달 함수를 구할 수 있게 된다. 동공 함수 상에 광학적 수차를 표현하여서 변조 전달 함수를 구하게 되면 영상의 주파수 영역과 수차와의 관계를 얻을 수 있다. 영상의 주파수 영역의 전체 크기의 합은 각각의 수차 모드의 크기에 대해서 이차함수 경향을 가진다는 것을 알 수 있다. 따라서 이차함수의 경향을 이용하여 세 번의 측정만으로 특정 수차 모드를 보정할 수 있다. 즉, 영상을 이용하여 각 수차 모드들을 빠르게 보정할 수 있는 것이 영상 기반 수차 보정법이다.
제안한 시스템을 이용하여서 기존 시스템과의 비교 및 분석을 진행하였다. 공초점 현미경을 이용하여 측정된 영상과 초점 변조 현미경을 이용하여 측정된 영상을 우선적으로 비교하였다. 우선 분해능을 비교해 보았다. 횡방향 분해능은 큰 차이가 없었지만, 공간 필터와 주파수 필터를 동시에 활용하는 초점 변조 현미경의 종방향 분해능이 공초점 현미경에 비해서 29% 향상됨을 알 수 있었다. 영상의 강도 단면을 비교해 본 결과 초점 변조 현미경이 효과적인 잡음 제거로 인해서 공초점 현미경에 비해서 높은 명암 대비를 가지는 영상을 획득할 수 있다는 것을 확인하였다. 실험적으로 영상 기반 수차 보정법이 세 번의 측정만으로 특정 수차 모드를 보상할 수 있는지를 검증하였다. 그리고 초점 변조 현미경에 수차를 보정한 결과는 수차를 보정하지 않았을 때 보다 신호 대비 잡음 비가 비약적으로 향상되는 것을 확인하였다. 투과 깊이가 깊어질수록 신호의 세기가 급격히 줄어들기 때문에 영상획득이 어려워지기 때문에 수차 보정으로 인한 신호 세기의 향상은 투과 깊이를 향상시키는 데 큰 효과를 가져온다고 할 수 있다.
결론적으로 영상 기반 수차 보정이 적용된 초점 변조 현미경의 경우 기존의 공초점 현미경에 비해서 높은 분해능, 영상의 명암 대비, 투과 깊이 그리고 보정 속도의 향상을 가져온다고 할 수 있다.
