Dna2 and Rad27 (yeast Fen1), two endonucleases critical for Okazaki fragment processing during lagging strand DNA synthesis, have been shown to interact genetically and physically. In this study, we addressed the functional consequences of these interactions by examining whether purified Rad27 of Saccharomyces cerevisiae affects the enzymatic activity of Dna2 and vice versa. For this purpose, we constructed Rad27DA (catalytically-defective enzyme with an Asp to Ala substitution at amino acid 179) and found that it significantly stimulated the endonuclease activity of wild type Dna2, but failed to do so with Dna2△405N that lacks the N-terminal 405 amino acids. This was an unexpected finding since dna2△405N cells were still partially suppressed by overexpression of rad27DA in vivo. Further analyses revealed that Rad27 is a trans-autostimulatory enzyme, providing an explanation why overexpression of Rad27, regardless of its catalytic activity, suppressed dna2 mutants as long as an endogenous wild type Rad27 is available. In support of this, we found that the C-terminal 16 amino-acid fragment of Rad27 was sufficient and necessary for the stimulation of both Rad27 and Dna2. Single or multiple amino acid substitutions in this region abrogated the stimulatory effect on both Dna2 and Rad27. Our findings provide further insight into how Dna2 and Rad27 jointly affect the processing of Okazaki fragments in eukaryotes.
Dna2와 Rad27 (효모의 Fen1)은 DNA 지연사슬의 합성 동안 Okazaki fragment의 processing에 중요한 endonuclease이며, 서로 상호작용하고 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서, 우리는 Saccharomyces cerevisiae의 정제된 Rad27이 Dna2의 효소 활성에 영향을 미치는지, 그 역 또한 성립하는지를 확인함으로써 그 상호작용의 기능적 결과를 연구하였다. 이를 위해, Rad27DA (179번 아미노산이 Asp에서 Ala로 치환되어 효소 활성이 상실된 Rad27)를 제작하였고, 이것이 wild type Dna2의 endonuclease 활성을 크게 증진시키나 N-말단의 405개 아미노산이 없는 Dna2Δ405N의 활성은 증가시키지 못함을 발견하였다. In vivo에서의 rad27DA의 과발현이 효모의 dna2Δ405N 돌연변이를 어느 정도 억제할 수 있기 때문에 위의 결과는 예상치 못한 발견이었다. 후속 연구를 통해 Rad27은 trans-autostimulatory 효소임이 밝혀졌고, 이것으로 endogenous한 wild type Rad27이 존재하기만 하면 효소 활성에 관계없이 Rad27의 과발현으로 dna2 돌연변이를 억제할 수 있음을 설명할 수 있게 되었다. 또한 우리는 Rad27의 C-말단의 16개 아미노산 fragment가 Rad27과 Dna2의 활성 증가에 필요충분조건이라는 사실을 발견하였으며 이는 위의 사실들을 뒷받침하는 결과이다. 더불어 Rad27의 해당 말단에서의 단일 또는 다수의 아미노산 치환은 Dna2와 Rad27에의 활성 증가 능력을 없어지게 함을 확인하였다. 본 연구는 진핵생물의 Okazaki fragment processing에서 Dna2와 Rad27이 어떠한 방식으로 함께 영향을 미치는지에 대한 이해를 키우게 될 것이다.
