Genetic factors contribute to virtually every human disease, conferring susceptibility or re-sistance, or influencing interaction with environmental factors. Single nucleotide polymorphisms (SNP) are has been suggested as a powerful tool to identify genes for complex disease. In this study, novel genes and genetic variations associated with or responsible for glaucoma development and pro-gression were discovered using case-control association study and molecular and cellular mechanisms underlying glaucoma etiology was elucidated.
To identify genes and genetic variants associated with glaucoma, specifically primary open-angle glaucoma (POAG) susceptibility, a case-control study was performed for 208 glaucoma cases (188 POAGs) and 933 controls. Thirty-two candidate genes showing drastically different expression patterns between glaucomatous and normal tissues were chosen and 134 tag SNPs covering those 32 candidate genes were genotyped. Two SNPs from NREP showed significant association with glauco-ma and also POAG susceptibility (P < 0.05). For fine-mapping of the candidate gene, additional 12 tag SNPs were selected and genotyped. Five SNPs located on NREP promoter were significantly associated with glaucoma and as well as POAG (0.00051 ≤ P ≤ 0.022 in co-dominant model). The haplotype CGCGG, one of haplotypes reconstructed with associated 5 SNPs, consisting of a risk allele of each SNP had 1.38-fold higher risk of POAG than the haplotype AAGCC with a non-risk allele (P = 0.0060). Also, the risk haplotype CGCGG showed significantly reduced promoter activity (P < 0.05).
Since NREP is a down-regulated in trabecular meshwork tissues under induced-high IOP and risk haplotype of NREP also showed low expression activity, we decided to examine the biological consequences of NREP knockdown. We first assessed apoptosis rate which is related with retinal gan-glion cell death, one of the POAG phenotype in NREP-knockdown cell. To explore the cell death sensitivity of NREP-knockdown cells, the NREP-knockdown cells and control cells were treated with various death stimuli. There was significant cell death in NREP-knockdown cells treated with starva-tion (FBS deprivation), as quantified flow cytometry and MTT assay.
To find underlying pathway of starvation-induced cell death, mammlian target of rapamycin (mTOR) downstream activity was investigated by immunoblot assay. NREP-knockdown cells showed a high level of S6K and 4E-BP phosphorylation, indicating higher activity of mTORC1. Also, the level of LC3-II, a marker for autophagy, suppressed by activated mTORC1 even under starvation. Therefore, impaired autophagy due to NREP deficiency sensitized to starvation-induced cell death and possibly leads to increased susceptibility to POAG.
Recently, genome-wide association (GWA) study demonstrated association of POAG with six SNPs that flanked the genes ZP4, PLXDC2, and TMTC2 located on chromosome loci 1q43, 10p12.31, and 12q21.31, respectively using a Japanese population, but these associations were not replicated later in an Indian population. A hybrid design involving exact testing of the reported makers plus fine mapping of the same region using additional markers was used to reduce the discrepancy of in linkage disequilibrium (LD) between an untyped, causal variation and typed markers between original population and study population.
30 SNPs including six reported in the three loci (i.e. ten SNPs in each locus) were genotyped in the initial stage of this study. Using these data, the genotype imputation was performed for all other SNPs in the loci with the Asian (CHB, CHS, and JPT) haplotype data and statistically analyzed as well as the directly typed ones for association with POAG susceptibility. Additionally, 5 imputed SNPs showing lower P values than genotyped 10 SNPs in 10p12.31 locus were also genotyped and analyzed.
POAG susceptibility association was strong and statistically significant with several SNPs, in-cluding the typed SNP rs7098387 [OR = 2.21 (1.49-3.27), P = 0.000080], located in an intergenic region between PLXDC2 and MIR4675 (or closer LOC100133024) on 10p12.31 locus (where 15 SNPs were typed and 231 imputed), instead of the originally reported SNP rs7081455 (P = 0.70), which was in a low linkage disequilibrium with rs7098387 (D'''' = 0.29, r2 = 0.001). Modest association was additionally observed with the reported SNP rs693421 [OR = 1.37 (1.10-1.71), P = 0.0056] and several others located around ZP4 and LOC100130331 on 1q43 locus (10 SNPs typed and 152 imputed). However, no association was observed with the reported SNP rs7961953 (P = 0.86) or any others on a 12q21.31 locus harboring an upstream part of TMTC2 (10 SNPs typed and 176 imputed).
In conclusion of first replication, POAG susceptibility was associated in Koreans with a haplo-type marked by rs7098387 rather than rs7081455on a 10p12.31 locus downstream of PLXDC2 and with another haplotype marked by rs693421 on a 1q43 locus harboring ZP4.
Susceptibility to POAG has recently associated with three intergenic SNPs on human chromo-some 2p16.3, just outside of the POAG-linkage locus GLC1H (2p15-16.2), in an Afro-Caribbean population. Especially, association of rs12994401 was very strong (odds ratio 35) and later replicated in Afro-Americans but not in Ghanaians or Japanese. An extended region was examined in this study to look for SNPs of cross-population association.
The three reported SNPs and all 63 SNPs considerably correlating with rs12994401 (r2 ≥ 0.3) in the African-descendent Yoruba were examined for POAG susceptibility. As these 66 SNPs were spread from 2p14 to 2p21, all SNPs in this extended region were imputed for susceptibility association tests.
No susceptibility association was detected with rs12994401 in comparisons between 933 con-trols and 188 POAG (or 175 high-tension glaucoma) or 226 total glaucoma cases (statistical power of 100%), as well as with all 19 other typed SNPs using logistic regression with adjustment for age and gender. The other 46 SNPs were deemed non-polymorphic in Koreans. Among 21,201 SNPs located in 2p14-21, only 4,260 were imputed to be non-monomorphic, but none of them passed a significance level of multiple testing. No association was observed when the samples were stratified by age or gender.
In conclusion of second replication, no typed or imputed SNPs within 2p14-21 showed association with susceptibility to POAG in Koreans, suggesting that the population inconsistency in 2p16.3 association was unlikely due to linkage disequilibrium differences.
다인성 질병의 발병 과정은 소수의 유전자에 의해 좌우되기 보다는 여러 유전자들의 복합적인 상호작용에 의해서 결정되며, 이로 인해 발병 기작의 규명 또한 어려움이 크다. 본 연구에서는 심각한 실명 원인인 녹내장의 유전적 질병 발병 경로를 후보 유전자 접근을 통한 환자군-대조군 연관 연구법을 통하여 찾아내었다. 우선 단일 염기 다형성 (Single nucleotide polymorphism; SNP)을 이용하여 질병 연관 유전변이를 발굴해 내고, 그 유전변이가 유전자에 끼치는 영향을 밝혀낸 후, 그 유전자가 어떻게 녹내장 발병에 관련되었는지 알아보았다.
녹내장 특히 개방각 녹내장 연관 유전변이를 찾기 위해 208명의 녹내장 환자 (188명의 개방각 녹내장 환자 포함)와 933명의 대조군 DNA 시료와 임상정보를 확보하였다. 문헌 조사를 통하여 녹내장 조직에서 발현량이 현저히 달라지고 녹내장 연관 locus에 위치한 32개의 유전자를 후보 유전자로 선정하였다. 선정된 후보 유전자들의 녹내장 연관성을 밝히기 위해 이들을 커버하는 134개의 tag SNP을 선택하여 유전형 분석을 실시하였다. NREP 유전자 5’ upstream에 위치한 2개의 SNP에서 녹내장 연관성을 보임을 확인한 후, 이 유전자와 녹내장 연관성을 좀 더 자세히 살펴보기 위해 이 유전자 내의 12개 SNP을 추가로 선정하여 유전형 분석을 해 보았다. 그 결과 NREP프로모터 지역의 5개 SNP에서 녹내장 연관성을 나타내었다 (0.00051 ≤ P ≤ 0.022). 다섯 개의 SNP을 AAGCC와 CGCGG 각각 두 개의 일배체(haplotype)을 형성하였고, 이 두 일배체 또한 녹내장과 연관성을 보였다 (P = 0.0060). 또한, 위험 일배체인 CGCGG는 낮은 프로모터 활성도를 보였다.
NREP 유전자의 녹내장 발병 경로 연관성을 찾아보기 위해 siRNA을 이용하여 유전자 발현량을 감소시킨 후 apoptosis 정도와 다른 세포 스트레스 자극 하에서의 apoptosis 정도를 측정하였다. NREP 감소 세포에서 apoptosis가 증가됨을 관찰하였고, FBS를 제거한 starvation 상황에서는 NREP 감소 세포의 apoptosis 정도가 대조 세포보다 현저히 증가함을 관찰할 수 있었다.
굶주린 상태에서의 NREP 결핍이 어떻게 세포의 apoptosis 정도를 증가시켰는지 관련된 세포신호전달 경로를 탐색하기 위해 세포 기아의 방어 기작인 autophagy 신호전달 경로를 살펴보았다. Autophagy는 주로 mTORC1이라는 mTOR complex에 의해 조절되는데 mTORC1 의 하위 분자인 S6-kinase와 4E-BP의 activity, 그리고 autophagy 마커인 LC3-II의 생성 정도를 western blot 실험으로 확인하였다. S6-kinase와 4E-BP의 acitivity가 증가하였고 기아 상태임에도 불구하고 LC3-II 양이 감소함을 보였는데 이는 NREP 결핍 세포에서는 비이상적으로 mTORC1 이 hyperactivation 된 것이라 생각할 수 있다. 그리하여 기아 상태에서 세포는 autophagy를 적절히 활성화 시키지 못하여 apoptosis가 증가한 것이라 결론 지을 수 있다.
최근 게놈 전체를 살펴볼 수 있는 Genome-wide association study (GWAS)가 여러 질병에 대해 수행되고 있다. 일본인에서 GWAS를 통한 3개의 녹내장 연관 유전지역을 찾아내었고 총 6개의 SNP에 의해 발굴되었다. 하지만 이 결과는 인도인에서 재현되지 못하여 본 연구를 통하여 그 지역을 좀 더 세세히 탐구하여 녹내장 연관 유전변이의 기능을 확인하고자 했다.
세 개의 연관 지역에서 발굴된 6개의 SNP외에 이들과 연관성이 있는 24개의 SNP을 추가 선정하여 분석하였다. 그리고 impuation을 통해 그 지역을 좀 더 자세히 mapping 하여 5개의 SNP을 추가 분석하였다. 총 분석한 35개의 SNP중 10p12.31 지역에 위치한 rs7098387 이 가장 큰 녹내장 연관성을 보였다 [OR = 2.21 (1.49-3.27), P = 0.000080]. 이 지역 내에 위치한 기존에 발표된 연관 SNP인 rs7081455은 녹내장 연관성을 보이지 않았고 (P = 0.70), 두 SNP간 LD가 매우 낮은 것으로 나타났다 (D’ = 0.29, r2 = 0.001). 즉 일본인에서는 두 SNP 간 LD 가 강해 (D’ = 1) rs7081455을 통해 rs7098387 의 녹내장 연관성을 찾아낼 수 있었지만 한국인에서는 두 SNP간 LD가 낮아 rs7098387을 직접 분석한 후에야 그 연관성을 찾을 수 있었다. 1q43 지역에서는 기존에 발표된 SNP인 rs693421에서 녹내장 연관성을 관찰할 수 있었고 [OR = 1.37 (1.10-1.71), P = 0.0056], 12q21.3 지역에서는 녹내장 연관 SNP을 찾을 수 없었다.
두 번째 replication study로 Afro-Caribbean에서 발굴된 2p16.3 지역을 연구하였다. 기존에 발굴된 3개의 SNP중 rs12994401은 Odds ratio가 34.93로 매우 높은 값을 가지고 있다. 하지만 이 SNP은 Afro-Americans에서는 재현되었지만 Ghanaians이나 일본인에서는 재현되지 않았다. 이런 상반되는 결과를 분석하기 위해 2p16.3 지역을 넓게 커버하는 63개의 SNP과 4,260개의 imputed SNP의 녹내장 연관성을 분석하였다. 하지만 총 4,323개의 SNP에서 녹내장과의 연관성을 보이지 않았다. 따라서 이 지역은 Afro-Caribbean, 혹은 아프리카인을 기원으로 둔 인종에 특이적인 녹내장 연관 지역이라 결론 지을 수 있었다.
