Angiogenesis is a complex and highly regulated process that is critical for tumor progression and me-tastasis. This process is regulated by several growth factors including vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A). VEGF-A is secreted by hypoxic tumor cells and surrounding tissues; it seems to be the major fac-tor under a variety of conditions associated with angiogenesis. Furthermore, receptors to VEGF-A are ex-pressed in not only endothelial cells but also various types of malignancies, in which they function in the autocrine and paracrine biological actions of tumor cells. To know real effect of autocrine and paracrine ac-tion of VEGF-A, it needs to consider functional correlation between expression patterns of VEGF receptors and effect of VEGF-A. In this project, I studied which condition and how autocrine and paracrine VEGF sig-naling affects to malignant tumor cells.
After brief introduction of this thesis in chapter 1, I elucidated that tumor cells-dependent expression of VEGF-A and its receptors contributes different dependency or signaling of autocrine VEGF-A in malignant tumors in chapter 2 and 3. In this research, I suggest malignant tumors classified into two groups; autocrine VEGF sensitive and autocrine VEGF resistant. Experimental results showed that analysis using the public microarray database Gene Expression Omnibus indicates significantly higher mRNA expression of VEGF and VEGFRs in colorectal cancer and high grade astrocytoma but not in hepatocellular carcinoma compared to normal tissue. Human malignant astrocytoma cell lines, U251-MG and U373-MG, and HT-1080 fibrosarcoma cells expressed relatively higher levels of VEGF and VEGFRs compared to hepatocellular and colorectal cancer cell lines. Administration of exogenous VEGF-A induced cell growth in a dose dependent fashion in these cells but not in colorectal and hepatocellular cancer cells, and blockade of VEGF inhibited cell survival only in U251-MG, U373-MG, and HT-1080 cells. Furthermore, blockade of VEGF-A using the doxycycline-inducible VEGF-A RNA interference system showed a significant anti-tumor effect in a murine HT-1080-xenograft model. This anti-tumor effect through the blockade of VEGF signaling was mediated by FAK and AKT pathway in vitro and in vivo. Thus, I hypothesize that tumor-cell dependent expression of VEGF-A and its receptors might influence autocrine VEGF-A signaling effects, and it act as key inducer of tumor growth as well as angiogenesis.
In chapter 4, I investigated the autocrine VEGF-A effects depending on neuropilin-1 expression pat-terns in glioblastoma cell lines. Glioblastoma is one of the most severe and frequent brain tumors for which there is currently no cure. Neuropilin-1(NRP-1) is well known as co-receptor of VEGFR1 or VEGFR2 in en-dothelial cells. I confirmed the correlation between autocrine VEGF-A effects and NRP-1 expression patterns; also, the interaction between non-modified NRP-1 and VEGFR1 was studied in glioblastoma cells. From these results, autocrine VEGF-A signaling might affect tum or cells growth through VEGFR1-NRP-1 pathway in glioblastoma cell lines.
In chapter 5, I demonstrated that density dependent-pericellular hypoxic condition sustained the hy-poxic inducible factor-1α (HIF-1α) through the Notch1 pathway, even in non-hypoxic condition. In this study, I evaluated HIF-1α expression responding to increasing cell density as an in vitro intercellular interaction. As results, pericellular hypoxia can be induced by increasing cell density, which can exert fundamental impacts on the specific target cell lines. Thus I first provided that intercellular interactions evaluated by the surrogate approach of increasing in vitro cell density resulted in pericellular hypoxia in fibrosarcoma and glioblastoma cell lines. Second, I sought to elucidate the HIF-1α maintenance through the Notch1 pathway responding to cell density induced pericellular hypoxia even in non-hypoxic condition. These results suggest that paracrine cell interactions associated with pericellular hypoxia lead to the induction of VEGF-A through Notch1 pathway in glioblastoma cell lines.
In conclusion, these functional mechanisms involved autocrine VEGF-A signaling explained a novel pathogenic mechanism and also suggested the alternative strategy for anti-VEGF therapy via careful stratification of patients who have a certain disease such as glioblastoma multiforme.
암세포가 성장하기 위해서는 신생혈관생성이라 불리 우는 Angiogenesis 과정이 필수적이다. 이는 암 종이 기존에 형성 되어있던 혈관으로부터 산소와 영양분을 얻기 위함이다. 이러한 기능은 혈관 내피세포 성장인자로 알려진 VEGF와 그 수용체들의 독특한 역할에 의해 조절된다고 알려져 왔고, 또 이러한 상호작용을 방해하기 위한 다양한 치료기법과 치료제들이 개발이 되어왔다. 하지만 최근 다양한 암 종 에서 암세포 자체에도 혈관 내피세포의 수용체들이 발현되고 있음이 알려지면서 암세포에 직접적으로 작용하는 혈관 내피세포 성장인자와 그 수용체들의 역할이 (autocrine-VEGF signaling) 활발하게 연구되고 있다. 본 문에서는 혈관내피 세포 성장인자와 그 수용체의 암세포 특이적인 역할과 그 역할을 위한 조건 및 세포 내 신호전달 체계를 규명하였다.
첫 번째 장에서는 본 논문의 서론과 개요를 제시하였고, 두 번째 장에서는 암세포의 성장 및 생존에 있어서의 autocrine VEGF signaling이 특이한 암세포 군에서만 영향을 미친다는 연구를 기술하였다. 대장암과 뇌종양 조직에서 암의 진행 정도에 따라 혈관 내피세포 성장인자와 그 수용체의 mRNA의 발현 정도가 증가함을 조사하였고, 이것으로 혈관 내피세포 성장인자에 관련된 신호체계가 암의 진행 정도에 있어서 중요한 역할을 하고 있음을 추정할 수 있었다. 게다가 6가지의 각기 다른 악성종양 세포 주에 혈관내피 세포 성장인자를 처리해주고 또 혈관내피세포 성장인자를 효과적으로 차단하는 단일항체와 그 수용성 수용체를 이용하여 그 신호체계를 차단해 주었을 때의 현상을 관찰하였다. 그 결과 6가지 암 세포 중, 혈관내피 성장인자를 상대적으로 많이 분비하고 그 수용체중 Neuropilin-1 (NRP-1) 의 발현이 높은 세포 주 에서 통계적으로 유의한 암세포 성장 및 성장 저해 효과를 보였다. 이러한 결과를 토대로 autocrine VEGF signaling은 기본적으로 혈관내피 세포 성장인자를 많이 발현하고, 그 수용체중 특히 NRP-1의 발현 정도에 따라 그 효과의 유무가 나뉘어짐을 제시하였다.
세 번째 장에서는 6가지 세포 주 중 육종 세포주인 HT-1080을 이용하여 그 세포 내 신호체계에 대해 연구하였다. 외부에서 혈관 내피세포 성장인자를 처리하거나 막아 주었을 때, FAK과 AKT의 인산화가 특이적으로 조절됨을 기술하였고, 이러한 신호체계는 FAK이 AKT 의 상위에서 작용함을 밝혔다. 또, 이러한 autocrine VEGF signaling을 in vivo 실험을 통하여 증명하였다. Nude mice에HT-1080 세포 주를 주입한 후, 혈관 내피세포 성장인자의 발현을 억제하자 항-신생혈관 생성 효과와는 별개로 종양억제 효과를 보였고, 이 때에 FAK 과 AKT 신호체계가 관여하고 있음을 밝혔다.
네 번째 장에서는 뇌종양 세포 주 중에서도 가장 예후가 좋지 않은 Glioblastoma (교모세포 종) 세포 주만을 선별하여 autocrine VEGF signaling에 관한 연구를 더 심화 있게 진행하였다. 그 결과, 9가지 교모 세포 종 세포 주 중, NRP-1이 정상적으로 발현되고 있는 세포 주에서만 autocrine VEGF signaling이 세포의 성장에 영향을 미치고 있음을 밝혔고, 또 이 NRP-1은 혈관 내피세포 수용체 1 (VEGFR-1) 과 상호작용을 통하여 그 신호체계를 연결하고 있음을 밝혔다.
정리하자면 악성 종양 중 NRP-1의 발현 정도에 따라 autocrine VEGF signaling의 효과를 예측할 수 있는 메커니즘을 2-4 장을 통하여 밝혀냈고, 이를 토대로 혈관 내피세포 성장인자를 목표로 하는 치료방법에 있어서 환자 군을 선별하는 데 있어서 본 연구의 결과가 중요한 기초가 될 것임을 기대해본다.
다섯 번 째 장에서는 산소결핍 상태가 아닌 환경에서 발현되는 HIF-1α와 그 발현 메커니즘에 대한 연구를 서술하였다. 기본적으로 HIF-1α는 산소결핍 상태의 환경에서 발현되는 단백질이라고 알려져 있지만 본 연구에서는 Notch1 신호전달 체계를 통하여 HIF-1α가 산소 결핍상태 환경이 아님에도 불구하고 그 단백질의 발현을 유지시키는 현상에 대해 밝혀냈다. 이 연구를 통하여 HIF-1α가 암이 상당히 진행된 상태에서만 발현되고, 또 그러한 상태에서만 치료 목적 물질로 인식 되어 온 데 반해, 상당히 초기 단계의 암 종 에서도 HIF-1α이 항암 목적 물질이 될 수 있음을 밝혀 내었다.
결론적으로 본 논문의 연구를 통하여 특정한 신호 체계를 통하여 HIF-1α가 유지되고 이는 암 종의 발전에 기여할 수 있음을 밝혀냈고, 암세포가 발현하고 있는 혈관 내피세포 수용체의 발현 특이성에 따라 상호 작용 할 수 있음을 제시하고 있다.
