Since yeast is often exposed to a number of environmental stresses, the ability to grow and produce more ethanol under these stresses is an important factor in industrial bioethanol processes. Trehalose is found in many organisms including Saccharomyces cerevisiae, and has been known to play an important role in enhancing the stress tolerance. In a previous study of our research group, five putative genes for trehalose biosynthesis and transportation (salB, salC, salD, salE, and salF) were isolated from Streptomyces albus (ATCC 21838). Among them only salC was functionally proved to encode trehalose-6-phosphate synthase. The gene of salE appeared to encode trehalose-6-phosphate phosphatase but its function was not proved yet. These two enzymes catalyze the key steps in trehalose synthesis.
In this study, firstly, it was investigated that heterologous expression of salC and/or salE genes could increase intracellular trehalose accumulation and consequently enhance stress tolerance and ethanol production in S. cerevisiae. We constructed six expression vector systems with different combinations of salC, salE, and promoter-terminator pairs. Two different sets of GAL10 promoter/GAL7 terminator and GAPDH promoter/terminator were employed. The vectors constructed were individually transformed into S. cerevisiae YPH500, and their performances were examined. A transformant containing the expression vector with GAL10 promoter and salC gene (YEG-SC) showed a considerably increased cell growth, trehalose accumulation, and ethanol and heat tolerance compared to the other transformants. When the cells were grown in a medium supplemented with 5% (v/v) ethanol, cell concentration of the transformant containing YEG-SC was 36% higher than that of the control strain. In the viability test under lethal ethanol (20% v/v) or heat (50 °C) stress conditions, this strain showed a much enhanced survival ratio.
However, GAL10 promoter required galactose, while the galactose utilization and fermentation efficiency in S. cerevisiae YPH500 strain was very low. Thus, we used a ??gal80 mutant of S. cerevisiae 2805 as another host, which was reported not to require galactose as an inducer. It was observed that the salC gene could be successfully expressed using glucose as the sole carbon source in the ??gal80 mutant containing YEG-SC. This transformant showed much higher survival in overall than the control strain in plate cultures under ethanol, heat and furfural stresses. When incubated in a buffer containing 12% (v/v) ethanol for 12 h, the cell viability of the transformant was maintained at about 94%, while that of the control was about 51%. In batch fermentations in a ethanol production medium containing 100 g/L glucose at 30 °C, no significant differences in growth rate and ethanol production were observed between the transformant and the control. In both cases, most of glucose was consumed in about 24 h producing 40.7 g/L ethanol with a yield of 39.7%. But, the transformant showed a higher cell growth rate and ethanol production than the control at high temperatures of 40 °C and 42 °C. At 40 °C, it was found to completely consume 100 g/L glucose in about 33 h, and the maximum ethanol concentration was achieved at 29.5h. The transformant produced 39.1 g/L ethanol and the ethanol yield was 43.7 % (theoretical yield: 51%) at 40 °C. The ethanol yield with the transformant was 11.6% higher than those with the control, while its ethanol productivity was slightly higher than that of the control.
These results indicate that heat and ethanol tolerances of yeast can be significantly improved by the expression of a single gene of salC only, which could be a very effective way of productivity enhancement and thus cost reduction in bioethanol production. To our knowledge, this report describes the first application of a trehalose biosynthetic gene of different origin to develop high-stress tolerance yeast strains.
이당류인 트레할로스는 다양한 생물 종에서 생성되고 이용되는데, 여러 외부 스트레스로부터 세포를 보호하는 특성, 즉 외부 자극에 대한 자기방어 기작에 중요한 역할을 하는 물질이다. 본 연구에서 효모의 트레할로스 생합성 유전자와 유사한 기능을 가지는, 방선균 유래 트레할로스 생합성 유전자 salC (trehalose-6-phosphate synthase)와 salE (trehalose-6-phosphate phosphatase)의 도입을 통한 효모의 트레할로스 축적량 증가 및 그로 인한 내성 강화 효과를 확인하고, 기초적인 바이오에탄올 생산균주를 개발하고자 하였다.
먼저, 효모 내에서 방선균 유래 트레할로스 생합성 유전자를 발현시킬 다양한 조합의 벡터들을 제작하여 Saccharomyces cerevisiae YPH500에 도입하고 그 특성을 비교하였다. 유도발현 프로모터인 GAL10 하류에 각 유전자를 삽입하고 제작된 재조합 균주를 갈락토스를 주 탄소원으로 사용하는 배지에서 배양한 결과, 대부분의 경우 트레할로스 생합성 유전자가 도입된 균주의 세포 성장, 트레할로스 축적량, 열 및 에탄올 내성이 대조군(빈 벡터 삽입 균주)에 비해 높게 나타났다. 분비보다는 세포 내에서 발현하는 벡터의 도입이 더 효과적이었으며, salC와 salE 유전자의 동시발현은 salC 유전자만 단독으로 도입한 경우에 비하여 오히려 비효율적인 것으로 관찰되었다. 글루코스를 주 탄소원으로 이용하기 위하여 구성발현 프로모터인 GAPDH 하류에 salC 유전자를 삽입한 벡터의 경우, 배양 특성에 있어 대조군과 거의 차이를 나타내지 않았다. GAL10 프로모터 조절 하에 salC 유전자만을 세포 내 발현하는 것이 가장 효율적인 것으로 판단되어, 해당 벡터 시스템(YEG-SC)을 이후의 연구에 사용하는 것으로 결정하였다.
YEG-SC 벡터가 도입된 S. cerevisiae YPH500 균주의 스트레스 내성과 에탄올 생산 특성을 다양한 조건에서 비교하였다. 최고 15% (v/v) 농도의 에탄올, 15 mM 의 furfural(목질계 바이오에탄올 생산을 저해하는 대표적 독성 물질)을 포함한 고체배지 상에서 salC 유전자 도입 균주의 생장이 대조군에 비해 향상된 것을 관찰하였다. 5% 에탄올이 첨가된 복합배지로 플라스크 배양을 수행한 결과, 재조합 균주의 최대 비성장 속도 및 최종 세포 농도가 대조군에 비해 각각 21%, 32% 가량 높게 나타났다. 고온(37 °C) 배양 시에도 상대적으로 높은 세포 성장을 보였으며, 특히 에탄올 생산이 크게 향상되었다. 같은 온도 조건(37 °C) 하에서 에탄올 생산량은 대조군에 비하여 약 36% 증가하였고, 해당 에탄올 농도는 salC 유전자 도입 균주의 30 °C 배양 시 최고 농도의 91% 수준이다. 20% 에탄올 및 50 °C의 온도 조건 하의 강한 스트레스로 인한 시간에 따른 생존율 감소를 비교한 경우에도 salC 유전자 도입 균주의 내성이 증진되었음을 확인하였다.
글루코스로 인한 GAL10 프로모터의 발현 억제 때문에 앞선 실험에서는 갈락토스를 주 탄소원으로 사용하고 글루코스 농도를 제한하였으나, S. cerevisiae YPH500의 경우 갈락토스 이용 및 발효 효율이 매우 낮아 salC 유전자 도입의 효과를 다른 연구 결과와 비교하는데 문제가 있었다. 따라서 갈락토스 없이도 GAL10 프로모터를 사용하여 외래 유전자를 발현 시킬 수 있는 것으로 보고된 gal80 결핍주에 YEG-SC 벡터를 삽입하여 salC 유전자 도입 균주와 대조군의 성능 비교 연구를 수행하였다. RT-PCR 결과로부터 글루코스를 유일 탄소원으로 사용한 배지에서 salC 유전자가 발현됨을 확인하였다. 2% 및 5% 글루코스 포함 배지를 이용한 기초 배양 특성 실험에서 gal80 결핍 salC 유전자 발현 재조합 균주 내의 높은 트레할로스 축적과 세포 성장 및 에탄올 생산 증가를 관찰하였다. 고체 배지 상의 스트레스 실험 결과, 재조합 균주가 상대적으로 높은 에탄올, furfural, 고온 내성을 보였다. 스트레스 강도에 따른 12시간 후의 생존율을 비교한 경우, 12% 에탄올에 노출 시킨 대조군의 생존율은 51% 수준으로 감소한 반면, 재조합 균주는 월등히 높은 94% 가량의 생존율을 유지하였다. 에탄올이 포함된 배지에서도 salC 유전자 발현 균주 의 세포 성장 및 글루코스 소모 속도가 약간 빠른 것으로 관찰되었다. 높은 온도에서의 세포 성장과 에탄올 생산 또한 대조군에 비해 높게 나타났다. 초기 글루코스 농도가 10%인 에탄올 발효 배지를 이용하여 30 °C, 40 °C, 42 °C 조건에서 회분식 배양을 수행한 결과, 30 °C 발효에서는 두 균주간의 배양 특성 차이가 거의 없었으나 (24시간 배양 후 40.7 g/L 에탄올 생산) 고온 발효 시 salC 유전자 발현 균주의 세포 성장 및 에탄올 생산 속도, 수율이 증대됨을 확인하였다. 40 °C 조건에서 29.5시간 배양 후 최대 에탄올 농도에 도달하였으며, 재조합 균주의 에탄올 생산량은 39.1 g/L 이었다. 대조군에 비하여 에탄올 수율 및 총괄 에탄올 생산성은 각각 11.6%, 6.1% 향상 되었다.
본 연구의 결과들을 종합해 본 결과, S. cerevisiae에 방선균 유래 trehalose-6-phosphate synthase 유전자를 도입하는, 지금까지 시도되지 않았던 방법으로 에탄올, 고온 등의 외부 스트레스 저항성이 증대된 에탄올 생산용 균주를 개발할 수 있음을 확인하였다. 추가적인 균주 개량과 공정 최적화를 통하여, 현재 생물공정 분야에서 걸림돌이 되고 있는 균주의 안정성 문제로 인한 공정설계 및 운전상의 제약조건을 극복한 고효율 바이오에탄올 생산공정을 개발할 수 있는 기반을 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
