Degenerative tissues develop diverse inclusions containing non-native proteins, and ubiquitin contents of them vary to lesions and pathologic stages. This study shows that inclusions can be classified into three types, containing proteins subjected to ubiquitination without aggregation (type-I), aggregation without ubiquitination (type-II), and both ubiquitination and aggregation (type-III). Type-I inclusion was developed by p62-mediated sequestration of ubiquitin conjugates generated under pro-oxidative environment, while type-II and type-III inclusions by aggregation of misfolded proteins. However, type-I and type-III inclusions share the common maturation process, including peripheral development of small inclusions, their retrograde transport to perinuclear region and formation of a muti-lobed structure. When concurrently developed, these two types of inclusions clustered to and mingled with each other at perinuclear region, resulting in a large mixed inclusion. On the other hand, type-III inclusions were developed as a densely packed structure, so that, when cells faced to a stressful environment, type-I inclusions attached to type-II inclusions localized on the way of retrograde transport, resulting in a mosaic-patterned inclusions. Thus, intensity, pattern and time to tinge of ubiquitin immunoreactivity for lesions containing inclusions can be determined partly by concurrent development of inclusions of different types.
Moreover, p62 dependent type-I inclusions can be further classified by several criteria such as localizatioin and morphology. Inhibition of ubiquitin-proteasome system (UPS) or autophagy-lysosome pathway (ALP) develops distinct type-I inclusion bodies that have different characteristics. Inhibition of UPS induces a large inclusion structure localized in microtubule organizing center (MTOC). Maturation of large single inclusion structure requires intact microtubule structure to transport small peripheral inclusions to MTOC region. In contrast, failure of ALP only develops cytoplasmic dispersed small inclusion bodies. Blockade of transcription or translation by treatment of actinomycin D or cycloheximide completely inhibit the formation of inclusion that induced by UPS inhibition. However, inclusions induced by ALP inhibition are not efficiently prevented by actinomycin D or cycloheximide. Simultaneous inhibition of two catabolic pathways can develops two distinct inclusion structures in single cells. Moreover, these two types of inclusions can be distinguished by the localization of inclusion component such as Tsc2. Tsc2 selectively accumulated in inclusions that induced by proteasome inhibition. These findings clearly show formation of distinct inclusions in different conditions and provide a valuable example for the classification of inclusion bodies found in pathologic environment.
To validate the formation of distinct pathologic inclusions in in vivo condition, mouse models of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson’s disease are introduced in p62 knockout mice. In agreement with cell based study, pathologic progression and inclusion formation in ALS mice did not affected by p62 deletion. However, deletion of p62 greatly attenuates the loss of dopaminergic neurons in a model of Parkinson’s disease. These results strongly support that different inclusion structures have distinct contributions to different pathologic conditions.
퇴행성 질환의 조직에서는 비정상적 구조의 단백질로 이루어진 단백질 응집체들이 형성되며 병리 상태의 진행이나 병소의 위치에 따라 형태나 유비퀴틴화 단백질의 축적등에서 다른 특징들을 보인다. 본 연구에서는 응집체를 그 특성에 따라 단백질의 엉킴 현상 없이 유비퀴틴화된 단백질들로 이루어지는 응집체 (제 1형 응집체), 단백질의 엉킴 현상에 의한 응집체 (제 2형 응젭체), 단백질의 엉킴 현상과 유비퀴틴화를 모두 수반하는 응집체 (제 3형 응집체)로 분류할 수 있었다. 제 1형 응집체는 p62에 의하여 유비퀴틴화 된 단백질들이 격리되어 만들어지며 제 2형 및 제 3형 응집체의 경우 단백질의 구조이상으로 인한 엉킴 현상에 의하여 형성되었다. 이때 제 1형과 제 3형 응집체는 세포 주변부에서 작은 응집체가 형성된 뒤 미세소관을 이용한 운반을 통해 중심체에서 작은 응집체가 모여 하나의 커다란 응집체를 형성하는 기작을 공유하고 있었다. 이와 같은 서로 다른 형태의 응집체들이 동시에 한 세포 내에서 만들어지고 섞이는 현상은 병리 조직에서 다양한 형태의 응집체들이 나타나게 되는 원인을 설명 할 수 있을 것이다. 이에 덧붙여 제 1형 응집체의 경우에도 서로 다른 환경에 의하여 형성되는 다른 특성을 가지는 두 가지 형태의 응집체로 재 분류 될 수 있었다.
이와 같이 분류된 응집체 형성이 실제 생체 내에서도 의미를 가지는가를 근위축축삭경화증과 파킨슨병의 모델을 p62가 제거된 생쥐에 적용하여 확인하였다. 세포 수준에서 확인한 결과와 동일하게 근위축축삭경화증에 수반되는 제 3형 응집체는 p62에 의해 조절되는 제 1형 응집체의 형성과 상관없이 형성되었으며 질병의 진행 역시 p62에 의하여 영향을 받지 않았다. 이에 반하여 파킨슨병의 원인이 되는 단백질들은 제 1형 응집체의 특성을 가지고 있었으며 p62가 제거된 생쥐에서는 파킨슨병을 유도하였을 때 관찰되는 도파민으로 활성화되는 신경세포들의 사멸이 크게 약화되었다. 이와 같은 결과는 질병의 진행에 있어 서로 다른 병리 환경에서 서로 다른 응집체들이 작용할 수 있음을 보여주는 증거가 될 수 있을 것이다.
