Cancer is a threatening disease for mankind that should be conquered in these days. For almost three decades, cancer research has been focused on changes in the structure and/or expression of protein coding genes. It is now known, however, that the molecular biology of cancer is much more complex than thought before, because cancer mechanisms are also related to various non-coding RNAs (ncRNAs). ncRNA studies in relation to cancer have been mostly concentrated on microRNAs (miRNAs) and hundreds of miRNAs in cancer were discovered up to now, while the functions of other ncRNAs were not examined well.
Brain cytoplasmic 200 (BC200) RNA is an ncRNA highly expressed in primate brain, thereby known as a neuron-specific ncRNA, and it has been regarded as a translational modulator for local protein synthesis at dendrites. BC200 was observed at high levels in various tumors of non-neural origins, especially showing higher expression in invasive carcinomas than in benign tumors of the breast. However, little is known about the reason and the consequence of high expression of BC200 in cancer. Uncovering the role of BC200 in cancer cells not only can contribute to better understanding of human tumorigenesis but also can be used to propose a novel mechanism of ncRNA. In this dissertation, biogenesis and function of BC200 have been investigated in cancer cells.
First, cancer-specific expression was verified with immortal cell lines and subsequent experiments were done in tumor cell lines, mostly in HeLa cells, which are derived from cervical cancer. Fluorescence in situ hybridization showed that BC200 is present mostly as punctuates in the cytoplasm of HeLa cells. When BC200 isolated from HeLa cells was subjected to direct sequencing, its sequences were heterogeneous and deviated from the genomic sequence with the addition of extra non-templated adenine residues up to 18 nucleotides. The extra adenine residues enhanced the affinity of BC200 to its binding protein. Expression of BC200 was not affected by the concentration of α-amanitin inhibiting RNA polymerase II in HeLa cells, indicating that BC200 is synthesized by RNA polymerase III, which is consistent with the previous in vitro data. Deletion analysis showed that no essential cis-element was present in the region beyond -118 upstream of the 5′ end of BC200, suggesting the regulatory elements for BC200 biogenesis lie in the region downstream of -118.
A yeast three-hybrid screen was employed to identify poly(C)-binding protein 1 (PCBP1) as a BC200-binding protein in HeLa cells. Interaction between BC200 and PCBP1 was confirmed by both in vivo and in vitro binding assay. PCBP1 binds through its KH1 and KH3 domains to the 3′ half region containing A-rich and C-rich domains of BC200. Overexpression of PCBP1 increased the cellular stability of BC200, suggesting that binding of BC200 to PCBP1 plays a role in maintaining metabolic stability of BC200. However, knock-down of PCBP1 showed no change in the stability of BC200. This might be due to the cellular existence of other poly(C)-binding proteins which can replace PCBP1 in stabilizing BC200. HeLa cells had higher content of BC200 than did HaCaT cells that produce less PCBP1, and BC200 was found to be more stable in HeLa cells. Therefore, it seems likely that PCBP1 contributes to higher level of BC200 in HeLa cells.
Overexpression of BC200 slightly stabilized $p21^{WAF}$ mRNA, which was known to be destabilized by PCBP1, and knock-down of BC200 destabilized $p21^{WAF}$ mRNA. Therefore, BC200 is likely to inhibit the destabilizing effect of PCBP1 by decoying PCBP1 from binding to $p21^{WAF}$ mRNA.
PCBP1 suppresses translation of phosphatase of regenerating liver (PRL)-3, a crucial factor for promoting tumorigenesis including cell migration, invasion and metastasis by interacting with GC-motifs in 5′ UTR of PRL-3 mRNA. It was observed by using the luciferase reporter system that overexpression of BC200 increased the translational efficiency of 5′ UTR in PRL-3 mRNA, while knock-down of BC200 decreased it. Overexpression of BC200 enhanced cell migration and invasion of HeLa cells, and knock-down caused the opposite effects. These data suggest that binding of BC200 to PCBP1 blocks the PCBP1’s ability to suppress PRL-3 translation and that eventually the up-regulated PRL-3 leads to enhanced metastasis.
In summary, this dissertation demonstrates that BC200 is highly expressed in the cytoplasm of cancer cells and that the high expression is directly related to causing tumorigenesis. These findings can contribute to better understanding of human tumorigenesis and provide mechanistic clues to novel functions employed by protein-binding ncRNAs in cancer cells. Furthermore, these finding may provide the basis on which BC200 could be used as a biomarker for cancer diagnosis and BC200 itself could be a drug target for the cancer treatment in the future.
오랜 노력에도 불구하는 암은 현재까지 정복되지 못하고 인류를 위협하는 질병으로 남아 있다. 지난 삼십여 년 동안의 암 연구는 주로 단백질 유전자의 발현과 구조 변화에 관심을 가져왔다. 그러나 다양한 non-coding RNA (ncRNA)들이 암 기작과 관련이 있다는 것이 밝혀지면서 암의 분자 생물학이 과거에 생각되었던 것보다 훨씬 더 복잡할 것이라 예상 하게 되었다. 암 관련ncRNA 연구는 대부분 microRNA (miRNA)에 집중되어 왔고 지금까지 수백 종의 miRNA들이 암 기작에 관여한다 것이 밝혀졌으나 다른 class의 ncRNA 기능에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다.
BC200 (brain cytoplasmic 200) RNA는 영장류의 뇌에서 과발현 되는, 신경세포 특이적 ncRNA로서 신경세포의 수상돌기에서 국부적으로 단백질 합성을 조절하는 인자로 여겨 지고 있다. 또한 BC200 RNA가 신경 조직 외에 다양한 유래의 종양 조직에서도 발현되며 특히, 유방암의 경우에는 양성 종양에 비해서 전이성 유방암에서 더 높은 발현을 보인다는 것이 보고되었다. 그러나 암에서의 BC200 RNA 과발현 원인과 역할에 관해서는 거의 알려진 바가 없다. 암 세포에서의 BC200 RNA의 생성 과정과 기능을 밝히는 것은 tumorigenesis에 대한 보다 깊은 이해를 도울 뿐 아니라 새로운 ncRNA의 기작을 제안할 수 있을 것이다. 따라서, 본 연구에서는 암 세포에서의 BC200 RNA 생성 기작과 기능을 밝히려 하였다.
먼저 BC200 RNA의 암 특이적 발현 양상을 영구 세포주를 이용하여 확인하였으며 차후의 실험들에서는 암 세포주, 주로 HeLa 세포주를 사용하였다. 형광제자리부합법 (fluorescence in situ hybridization)을 통해BC200이 HeLa 세포의 세포질에 주로 존재하는 것을 관찰하였다. HeLa 세포에서 얻은 BC200 RNA의 염기 서열을 직접 분석한 결과, BC200 염기 서열에 최고18개까지 다양한 개수로 아데노신이 추가되어 있었으며 이런 아데노신의 추가가 결합 단백질에 대한BC200의 친화력을 증가시키는 것으로 확인되었다. 세포 배양 시 알파 아마니틴 처리를 통해RNA 중합 효소 III가 BC200 RNA를 전사하며, 염기서열 결실 분석으로 BC200 유전자의 앞 -118 이내의 염기서열에 BC200전사 조절 인자가 존재할 것으로 예측되었다.
효모를 이용한 삼중 하이브리드 방법 (yeast three hybrid)으로 BC200 RNA의 결합 단백질로서 PCBP1 (poly(C)-binding protein 1)를 찾았으며 BC200 RNA와의 특이적 결합을 in vivo와 in vitro에서 모두 확인하였다. PCBP1은 KH1과 KH3 domain을 통해 BC200의 A-rich와 C-rich domain을 포함하는 3′ 쪽 반과 결합하였다. PCBP1을 HeLa 세포에서 과발현 시키면 BC200 RNA의 안정성이 증가하며 이는 PCBP1과 BC200의 상호작용이 BC200의 대사적 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 할 것이라는 사실을 의미한다.
BC200가 과발현 되면 PCBP1에 의해서 불안정화 된다고 알려진 $p21^{WAF}$ mRNA 의 안정성이 증가하고 BC200의 발현이 감소되면 안정성이 감소되는 것이 관찰되었다. 그러므로 BC200이 $p21^{WAF}$ mRNA에 결합하는 PCBP1을 유인함으로써 PCBP1의 $p21^{WAF}$ mRNA 불안정화 효과를 억제하는 것으로 보인다.
PCBP1은 PRL (phosphatase of regenerating liver)-3 mRNA의 5′ UTR에 존재하는 GC motif들에 결합하여 세포 이동과 전이를 일으키는, 중요한 인자인PRL-3의 단백질 합성을 저해한다. Luciferase reporter system을 이용한 단백질 생성효율 확인 실험 결과, BC200의 과발현은 PRL-3 단백질 합성 효율을 증가시키고 BC200의 knock-down은 감소시켰다. 또한, BC200이 세포의 이동성과 전이성을 증가시키는 것을 확인하였다. 이는 BC200이 PCBP1에 결합함으로써 PCBP1의 PRL-3 단백질 합성 저해 기능을 방해하여 결과적으로, 늘어난 PRL-3로 인해 세포 전이가 증가됨을 보여준다.
본 연구는 BC200이 암 세포의 세포질에 과발현 되어 존재하며, 처음으로 BC200의 과발현이 암 생성을 직접적으로 유발한다는 사실을 밝혔다. 본 연구 결과는 앞으로 BC200 RNA를 암 진단 마커나 암 치료 타겟으로 개발할 수 있는 기반이 될 것이다.
