Inside cells, complex molecular networks composed of a number of bio-molecules are dynamically regulated to exert specific cellular functions. Also, many of the drugs or bioactive compounds were discovered fortuitously without a priori knowledge of their physiological targets. Therefore, comprehensive analysis of molecular interactions and elucidation of molecular targets of drugs is essential for understanding the structures and functions of molecular networks and mode-of-actions of drugs. Several technologies have been exploited for probing molecular interactions. However, all these technologies suffer from diverse intrinsic problems. To overcome these limitations, I present a platform called ‘IntraCellular SupraMolecular Assembly Readout Trap for Interactions (InCell SMART-i)’ to directly visualize dynamic molecular interactions within living cells at the single cell level with high sensitivity and selectivity. In
chapter 1, I evaluated the concept of InCell SMART-i and explored its technological proper-ties. Genetically engineered, labeled ferritin is used to form biological nanoparticles displaying bait and prey molecules inside cells. These specific molecular interactions induce supramolecular assembly of nanoparticles into nanoclusters on a timescale of seconds, visualizing spatiotemporal dynamics of mole-cular target interactions inside live cells. This time/space-resolved, real-time detection nanosystem with a small molecule as an inducible switch was used to monitor various types of biomolecular interactions, including drug-target, kinase-substrate, and signal-induced protein-protein interactions, inside living cells. Also, interactions between 30 different Ras small GTPases and Raf were systemically analyzed with a simple screening platform.
In chapter 2, I introduce an expanded version of InCell SMART-i using multiple nanoparticles to overcome some potential limitations in the platform using single kind of nanoparticle. Association do-main of CaMKIIα and DsRed fluorescent protein were employed as alternatives of ferritin nanoparticles in InCell SMART-i. Applying multiple biological nanoparticles to InCell SMART-i resulted in more convenient and powerful platform for screening molecular interactions and monitoring signal-dependent interactions. Also, combination of association domain of CaMKIIα and DsRed led to efficient InCell SMART-i in nucleus.
In chapter 3, I represent another platform of InCell SMART-i called ‘landing assay’. By using nanocluster as an intracellular synthetic compartment, bait and prey are recruited to and co-localized in nanocluster according to their interaction. With its efficiency and versatility, landing assay was used to monitor spatiotemporal dynamics of molecular interactions and visualize drug-target interaction as well as protein-protein interaction.
세포 내의 다양한 생체 분자들은 서로 상호작용하며 복잡하고 거대한 네트워크를 형성한다. 그리고 이러한 네트워크는 세포 외부의 신호를 받아 역동적으로 변화하며 세포의 기능을 조절한다. 또한 약물과 같은 생체 활성 조절 물질들은 생체 분자들과 상호작용하며 네트워크의 기능을 조절함으로써 치료효과를 가져올 수 있다. 하지만 많은 약물의 경우 분자 수준에서의 기작이 정확하게 밝혀지지 않은 채 질병 치료에 사용되고 있다. 따라서 생체 분자들의 상호작용과 약물의 생체 내 타겟을 규명하는 작업은 복잡한 분자 네트워크의 이해와 더불어 약물의 정확한 기작의 이해와 효율적인 치료방법을 개발하는 데에 매우 필수적인 과정이다. 지금까지 많은 기술들이 이러한 생체 분자간의 상호작용을 밝히기 위해 개발되어 왔지만 각각의 기술들은 다양한 내재적 문제들로 인해 사용함에 있어서 제약이 있었다. 이러한 문제점들을 극복하고자 InCell SMART-i (IntraCellular SupraMolecular Assembly Readout Trap for interaction) 라는 새로운 기술을 개발하였다. 이 기술은 살아있는 세포 내에서 역동적인 분자간의 상호작용을 실시간으로 관찰할 수 있으며, 매우 높은 민감도와 선택도를 지니고 있다. 본 학위논문에서는 InCell SMART-i기술을 크게 3가지 부분으로 나누어 소개하고 있다.
제 1장에서는 InCell SMART-i기술이 실제로 세포 내에서 구현되는 지와 어떠한 기술적인 특징을 지니고 있는 지에 대한 연구 내용이다. InCell SMART-i는 페리틴 (ferritin)이라는 생체 내에 존재하는 나노 입자에 bait와 prey를 달아주어 이들이 서로 상호작용 하였을 때 페리틴 입자가 서로 연결되어 세포 내에서 나노 고단위 복합체를 형성하는 것을 기본 원리로 한다. 이러한 나노 고단위 복합체는 분자 간의 특이적인 결합을 통해 형성되며, 그 결합 과정의 시공간적인 역동성을 형광현미경을 통해 실시간으로 관찰할 수 있었다. 또한 InCell SMART-i를 이용하여 약물과 타겟 단백질, 단백질과 단백질 간의 상호작용 등 다양한 형태의 분자 간의 상호작용을 관찰할 수 있었다. 뿐만 아니라, 기술의 용이함과 높은 선택도의 특징을 바탕으로 30개의 Ras small GTPase와 effector간의 상호작용을 쉽고 빠르게 검출할 수 있었다.
제 2장에서는 1장에서 소개한 페리틴과 같이 한 가지 종류의 나노 입자를 사용한 InCell SMART-i기술의 잠재적인 단점들을 진단하고 다양한 종류의 나노 입자의 사용을 통한 해결책을 제시하는 내용의 연구이다. 이 장에서 CaMKIIα와 DsRed단백질을 페리틴과 함께 복합적으로 사용한 InCell SMART-i기술을 소개하고 이렇게 다양한 나노 입자의 사용을 통해 분자 간의 상호작용을 더 쉽고 명확하게 관찰할 수 있는 플랫폼을 개발하였다. 또한 CaMKIIα와 DsRed단백질의 사용으로 인해 핵에서의 InCell SMART-i 효율을 높일 수 있었다.
제 3장에서는 InCell SMART-i의 또 다른 플랫폼인 ‘landing assay’에 대해 소개하였다. Landing assay는 나노 고단위 복합체를 세포 내에서 합성된 하나의 공간 (compartment)으로 사용하여 그 곳에서 bait와 prey간의 상호작용을 분석하는 방법이다. 이 방법 또한 제 1, 2장에서와 마찬가지로 세포 내의 분자 간의 상호작용을 시공간적으로 측정이 가능하며, 플랫폼의 범용성으로 인해 일반적인 단백질-단백질 상호작용 이외에 약물-타겟 간의 상호작용 등 다양한 종류의 생체 분자 간의 상호 작용 분석에 적용할 수 있다.
이러한 InCell SMART-i기술은 살아있는 세포 내에서 분자 간의 상호작용을 실시간으로 분석할 수 있고 직접적인 readout을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 높은 민감도와 선택도, 기술 절차의 용이함과 범용성을 바탕으로 다양한 종류의 분자 간의 상호작용을 쉽고 빠르게 검출 할 수 있었다. 따라서 InCell SMART-i기술은 기존의 개발된 기술들의 단점들을 극복한 더 좋은 기술로서 생체 내에서 일어나는 역동적인 네트워크 분석과 약물의 기작 연구, 그리고 새로운 치료제의 개발 등 생명 현상과 관련된 다양하고 의미 있는 연구들을 효과적으로 수행하는 데 도움을 줄 수 있을 것이라고 기대한다.
