Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is a homo-trimeric DNA-encircling protein that functions as a polymerase processivity factor and also a regulator in DNA metabolism. Post translational modification (PTM) on PCNA by Small-ubiquitin-modifier (SUMO) contributes to suppression of hyper-homologous recombination by binding Srs2. Srs2 is known as a DNA helicase that inhibits recombination as it disrupts Rad51 nucleoprotein filaments, functionally cooperates with PCNA. It shows preference for interacting directly with the SUMO-modified form of PCNA. Recruitment of Srs2 to SUMOylated PCNA during S phase is poorly understood in molecular level, while enormous studies have been done during several decades. To better understand the Srs2 recruitment mechanism on SUMOylated PCNA, we studied Srs2 C-terminal region in structural point of view and mapped interaction surface for SUMO and PCNA binding by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopic, Electron microscopic (EM) and biochemical methods. Interestingly, we found that SUMO-binding motif (SBM) on Srs2 interferes the interaction between PCNA interacting motif on Srs2 and PCNA resulting in auto-inhibitory effects for PCNA binding. Based on the EM analysis, SUMO moiety on SUMOylated PCNA has a dynamic hinge motion through space, whereas Ubiquitin moiety on Ubiquitylated PCNA shows a restricted motion resulting from interacting with PCNA. Structural studies on Srs2-SUMOylated PCNA complex revealed that flexible SUMO moiety becomes less flexible and bent to PCNA surface during complex formation. N-terminus of Srs2 regulatory region is oriented to the center of PCNA for proper Srs2’s anti-recombinogenic role. Taken together, we could explain Srs2 recruitment mechanism step by step in structural point of view with model.
PCNA는 DNA의 복제, 유전자 재조합 및 손상 DNA의 회복 등 전반적인 DNA의 대사 과정에 중요한 역할을 하는 단백질이다. 이 PCNA는 다양한 세포내의 환경에 맞춰 단백질 번역 후 변형 (Posttranslational modification) 과정을 거쳐 복합적인 역할을 수행한다. 특히 PCNA는 세포의 S-phase상에서 SUMOylation을 거쳐 Srs2 단백질을 소환하게 되고, 소환된 Srs2는 RAD51의 nuclear filament의 형성을 억제해 과도한 유전자 상동재조합을 막아 세포가 안정하게 살 수 있게 해준다. 이 과정 에서 가장 중요한 부분이 Srs2의 C-terminal의 regulatory region과 SUMOylation된 PCNA사이의 상호작용이라고 알려져 있지만, 이 작용에 대한 분자 수준의 구체적인 연구는 아직까지 성공하지 못하였다.
본 논문은 핵자기공명 분광법을 이용해 Srs2의 C-terminal 말단의 6개의 아미노산이 SUMOylation된 PCNA와의 상호작용에 충분하다는 사실을 밝혀 냈다. 특히 Srs2의 SUMO-binding motif (SBM)의 상호 작용은 일반적인 SUMO와 SBM의 상호작용과 공통적으로 소수성이지만, Srs2는 양전하와 음전하의 정전기의 끌림 작용이 아닌, 양전하간의 반발력에 의해 결합하는 방향이 결정되는 독특한 특징을 가지고 있었다. 두 번째로 Srs2 C-terminal 말단 자체가 구조적으로 유연하며, 쉽게 구조가 유도 되어짐을 아미노산의 배열의 유사성을 이용한 분자 계산, 핵자기공명 분광법, 그리고 Circular Dichroism 분광법을 이용해 밝혀 냈다. 세 번째, Srs2에서 독자적으로 PCNA와 상호 작용을 하는 부분을 밝혀 냈으며, Srs2내에 존재하는 PCNA interacting motif는 지금까지 알려진 일반적인 PIP가 아닌 새로운 motif라는 것을 밝혀 냈다. 또 PCNA interacting motif는 SBM의 바로 앞 부분에 위치하여, SUMOylation이 된 PCNA에 결합하기 위해 그를 인식하는 과정에서 다른 SUMOylation된 단백질과 구분하고 정확히 SUMOylation된 PCNA를 인식할 수 있는 효과를 극대화할 수 있음을 밝혀 냈다.
또한, PCNA에 SUMOylation이 된 후 SUMO는 동역학적으로 자유롭게 hinge motion을 하며, Srs2의 C-terminal 말단의 regulatory region과 결합한 후 안정화되었고, 이를 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다. 마지막으로 Srs2의 C-terminal 말단내의 SBM과 PCNA interacting motif는 서로 상호작용 하며, SBM은 Srs2가 SUMOylation되지 않은 PCNA에 잘 붙지 않도록 하는 대신, 정확히 SUMOylation된 PCNA에만 결합하도록 하는 auto-inhibition기작에 대한 가능성을 확인하였다. 이를 종합하여, Srs2단백질이 SUMOylation된 PCNA에 소환되는 과정과 SUMOylation된 다른 다양한 단백질을 Srs2가 어떻게 인식할 수 있는가, 또 Srs2가 PCNA에 결합할 수 있는 motif를 가지고 있음에도 어떻게 SUMOylation이 되지 않은 PCNA에 상호작용을 하지 않는가에 대한 원인을 밝혀내고, Srs2의 SUMOylation된 PCNA에 소환되는 과정에 대한 분자적 수준의 모델을 제시하였다.
