CD40 and CD40L molecules are pairs of ligand/receptor that belong to the tumor necrosis factor (TNF) and TNF receptor (TNFR) superfamily. They play a critical role in both humoral and cellular immune responses. They have also been implicated in T cell-mediated B cell activation process that occurs through interaction of CD40 with CD40L expressed on B cell. Mutations of CD40 and CD40L are strongly associated with a rare genetic disease, HIGM. HIGM is a primary immunodeficiency syndrome characterized by normal or increased serum IgM levels and low or absent IgG, IgA, and IgE levels in serum.
In this thesis, the crystal of CD40 and CD40L complex was determined to obtain structural information how the ligand interacts with the receptor. Surprisingly, the crystal data reveals that CD40 binds to CD40L in 2:3 ratio. All crystal structures of TNF-TNFR family complexes reported so far show only 3:3 complex of the ligand and the receptors. A series of mutations of CD40L are generated to indentify regions important for function. Mutants that have low activity by NF-κB luciferase reporter assay selected for further analysis. Among them, one mutant that has normal ligand binding affinity but with very low NF??B activation function was identified. Crystal structure of this mutant shows that the overall structure of the receptor-ligand complex is preserved.
CD40 수용체와 CD40 리간드는 Cell-Mediated 면역체계 과정 중 T-cell 과 B-cell의 interaction에 관여하는 단백질로서 이 두 단백질의 결합에 의해 pro-inflammatory cytokine을 분비하거나 또는 B-cell, T-cell을 activation시켜 면역세포로써의 분화나 증식이 일어나도록 자극을 준다. CD40 리간드는 면역세포를 직접적으로 자극함으로써 면역체계를 활성화시켜 종양세포를 공격하거나 그 리간드와 수용체의 상호작용을 막음으로써 조직이나 세포를 이식할 때 면역거부반응을 억제하기 위한 치료제로 응용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
CD40 수용체와 리간드는 종양괴사인자에 속하는 단백질로써 현재까지 그 복합체의 구조가 밝혀진 종양괴사인자로는 DR5_TRAIL, TNF1-β_TNFR1, BAFF_BAFFL이 있으며 이들은 모두 유사한 구조적인 특징을 가지고 있다. 리간드의 경우 10개의 β-sheet로 구성되어 있으며 수용체의 경우에는 여러 개의 disulfiede 결합을 가지는 cysteine-repeat domain을 가지고 있다. 하지만 대부분의 종양괴사인자가 수용체:리간드가 3:3으로 결합하고 있음과 비교하여 CD40 복합체의 경우에는 수용체:리간드가 2:3으로 결합하고 있었다. 리간드끼리 결합하는 부위의 돌연변이 실험을 통해 이러한 결합이 정확한지 확인하려 하였고 이 역시 야생형 구조와 동일한 2:3의 구조를 보였다.
수용체와 리간드의 결합 비율을 확인하려는 실험 중 야생형과 전체적으로 구조는 동일하나 NF-κB, IL-6의 활성은 낮게 나오는 것을 발견하였다는 점에서 의미있는 돌연변이형을 발견하였다.
지금까지의 이러한 실험결과를 토대로 하여 CD40의 수용체와 리간드는 multimerization을 통하여 세포내로 신호를 전달할 것이라는 것과 돌연변이형의 경우에는 어느 정도의 oligomerization은 가능하나 많은 양의 수용체, 리간드가 multimerization을 이루기에는 그 결합성 친화도가 낮을 것이라는 결론을 유추해 볼 수 있었다.
