Heavy metals represent major environmental hazards to human health. In particular, cadmium is very toxic and carcinogenic even at very low concentrations. Living organisms have developed various defense mechanisms to counteract cadmium toxicity. Glutathione (GSH), a main sulfur compound in yeast, is a highly distinctive amino acid derivative with several important roles involved in the cellular defense to heavy metals and oxidative stress. The methylotrophic yeast Hansenula polymorpha is characterized with high tolerance to various stress induced by heavy metals, xenobiotics (drugs) and environmental pollutants. Particularly, GSH is essential for the methylotrophic growth of this yeast. These peculiar physiological characteristics make H. polymorpha as a good model system to study the metabolism and functions of GSH in the response to stresses generated by heavy metal cadmium and sulfur starvation.
In this study, various sets of DNA microarray experiments were carried out in order to analyze global transcriptional responses under stress conditions induced by cadmium and sulfur depletion, and thus to elucidate the physiological role of GSH and sulfur biosynthesis in the heavy-metal detoxification mechanism in H. polymorpha. First, to gain insight about the mechanism of cadmium detoxification, exponentially growing cells were untreated or treated with 0.3 and 0.6 mM cadmium, respectively, for DNA microarry experiments. Temporal changes of transcriptome analyzed at 15, 30, 60, and 120 min incubation after cadmium treatment revealed that the folds of induction and repression were more augmented with the longer exposure time and at the higher concentration of cadmium, indicating that the extent of gene expression change increased with the increase of exposure period and cadmium dose. Exposure to cadmium up to 2 hours induced several subsets of genes relevant to oxygen stress response, protein degradation, sulfur amino acid metabolism, and sulfur salvage pathway in H. polymorpha. On the other hand, repressed genes were found in the categories of other amino acid metabolisms related to biosynthesis of glutamine, glutamate, threonine, and methionine, and the cellular biogenesis such as ribosome proteins. This supports strongly the notion that among the enzymes involved in amino acid metabolism, only those of the sulfur amino acid biosynthetic pathway are specifically induced by cadmium.
To investigate the function of a H. polymorpha Met4 homologue, encoding a transcriptional regulator for sulfur assimilation genes, in the global regulation of gene expression under stress conditions, we constructed the H. polymorpha MET4 gene deletion strain (hpmet4) and performed DNA microarray experiments under stress conditions caused by sulfur limitation. The resulting microarray data of the wild type and hpmet4 strains were compared in order to identify a set of genes regulated by HpMet4p. Among a bunch of genes belonging to the putative HpMET4-regulons, sulfur assimilating genes such as several MET genes and SUL1 gene are were highly induced in the wild-type strain under sulfur limitation, while their expressions were not so much changed or rather decreased in the hpmet4 strain. The promoter analysis of these genes revealed the presence of common motif for the Cbf1 binding site (TCACGTG), supporting that the expression of these genes are mediated by HpMet4 regulator associated with Cbf1p in H. polymorpha.
In this study, the whole-genome cDNA microarray was used for transcriptome analysis of H. polymorpha to obtain comprehensive information on gene function and regulatory networks involved in the cadmium detoxification and sulfur regulation. The global transcriptional profiling study allowed us to identify novel H. polymorpha genes responded to cadmium treatment, which could be usefully exploited for the development of yeast whole-cell sensing system of environmental pollutants and for the rational design of engineered yeast strains with artificial genetic circuits to improve capacity of cadmium detoxification.
중금속은 인간의 건강에 해로운 주된 환경 위험물질들이다. 생명체들은 이를 극복하기 위한 저항 기전(resistance mechanism)을 작동하게 되는데, 글루타치온(GSH)은 세포 내에서 가장 풍부한 thiol로 중금속 및 xenobiotics같은 환경오염 물질의 독성에 대한 방어에 중요한 역할을 한다. 따라서 세포 방어(cell defense)와 관련된 GSH의 생리적 기능 규명은 생명공학과 환경 보호에 활용될 수 있는 중요한 정보를 제공하게 된다. 특히 메탄올자화 효모 Hansenula polymorpha는 메탄올 대사에 GSH을 필수적인 요소로 필요할 뿐 만 아니라 스트레스에 높은 내성을 보이는 생리학적 특성을 가지고 있어서 카드뮴과 황 고갈로 인해 유발되는 스트레스의 반응 기전으로서 GSH 생합성 경로 및 기능 연구에 매우 적합한 모델 생명체이다.
포스트 지놈 시대를 맞이하여 산업적 유용미생물의 이용기술은 생명체의 설계도인 유전체 염기서열 해독과 총체적인 발현양상 및 기능분석을 통한 유전체 정보 청사진을 확보하고 이를 토대로 한 체계적이고 통합적인 미생물 재설계 및 발효공정 기술 개발로 이루어지고 있다. 따라서 본 연구에서는 H. polymorpha DNA microarray 를 활용한 유전체 발현양상 분석을 통해서 중금속 카드뮴 노출 및 황 결핍에 의한 스트레스 조건에서 H. polymorpha의 특이한 생리 및 대사활성에 관련된 총체적인 유전자 발현 정보를 제공함으로써, 신규 미지 유전자들의 기능 유추 및 산업적으로 유용 유전자원 발굴, 발현 조절망에 관한 청사진을 확보하고자 하였다.
우선적으로 카드뮴 노출에 대한 H. polymorpha의 반응 기작을 이해하기 위해, H. polymorpha 야생형 균주에 0.3 mM CdSO4과 0.6 mM CdSO4을 처리한 후 각각 0분, 15분, 30분, 60분, 120분 후에 시간에 따른 유전체 발현 양상을 분석하였다. DNA Microarray를 수행하여 얻은 scatter plot 그래프를 적용하였을 때, 처리한 카드뮴의 농도 및 노출 시간의 증가에 따라 발현 양상이 변화하는 H. polymorpha 유전자들의 수가 점차 증가함을 알 수 있었다. 카드뮴 처리 농도와 시간에 따라 스트레스 관련 방어 시스템에 관여하는 유전자군, 세포 내에서 일어나는 각종 대사 관련 유전자군, 단백질의 분해 또는 지질의 산화에 관련된 유전자군들이 발현이 증가하는 경향을 보였다. 이들 중 특히 질소 및 황 대사과정과 아미노산의 대사와 관련된 유전자군과 산화된 지질의 무독화에 기여하는 유전자의 발현 증가가 두드러졌다. 반면, 단백질의 합성에 관련하는 리보솜 단백질 등의 유전자군들의 발현은 감소하는 경향을 보였다. 위의 결과를 토대로 중금속 카드뮴에 의해 민감하게 반응하는 신규 유전자를 70종 이상 선별하였고, 이중 10배 이상 발현이 증가하는 유전자 10 여종은 중금속 특이적인 프로모터 개발의 잠재력을 지닌 것을 확인하였다.
본 연구에서 상기 수행된 microarray 분석 결과는 H. polymorpha에서도 GSH와 황 대사 활성이 카드뮴 비독화(detoxification) 과정과 밀접하게 연계되어 있음을 시사하고 있다. 특히, H. polymorpha에서는 카드뮴에 노출된 경우 황 대사 관련 유전자군들의 전사 조절 단백질 유전자로 유추되는 HpMET4유전자의 발현 유도가 관찰되었다. 이에 GSH 생합성 및 카드뮴 내성에서 H. polymorpha HpMET4의 역할과 기능을 규명하기 위해서 HpMET4 결손 및 과발현 균주를 제작하여 유전체 발현 양상의 변화를 분석하였다.
그 결과 야생형과 비교하였을 때 HpMET4 유전자의 결손으로 발현이 감소하는 유전자들을 살펴보면 황 동화 기작 및 황 포함 아미노산 생합성 관련된 MET 유전자군들 뿐만 아니라 일부 세포 내 수송이나 스트레스 방어 시스템과 관련된 유전자들의 발현이 두드러지게 감소되었다. 특히 이들 유전자들의 프로모터들은 Met4p와 함께 결합하여 작용한다고 알려져 있는 Cbf1p 결합 모티프 (TCACGTG)가 공통적으로 발견되었다. 이들은 HpMet4p 단백질에 의하여 직간접적으로 발현이 조절되는 유전자들이며 조절인자에 의한 발현 조절 네트워크에 관한 중요한 정보를 제공한다 할 수 있다.
본 연구 결과 확보된 카드뮴에 의해 반응하는 신규 유전자들과 HpMet4p의 조절을 받는 유전자 군에 대한 발현 양상 정보들은 유용 유전자원 발굴과 황 생합성 경로의 이해와 이를 바탕으로 한 재설계 기술 개발에 매우 유용하게 활용 될 것이다. 특히 본 연구를 통해서 발굴된 카드뮴 특이적 신규 프로모터들은 카드뮴 감지용 재조합 효모 개발로 이어졌으며, 환경 모니터링용 전세포 바이오 센서 (whole cell biosensor) 개발에 필요한 유용한 원천 기술이 될 것이다.
