Fluorescence lifetime imaging microscope (FLIM) is a promising method which provides good contrast in bio-specimen. Fluorescence lifetime is quantitative value and independent of concentration of fluorophores and laser excitation power. Also, this value is sensitive to local environment such as pH, charges, refractive index, temperature etc. so that it is possible to perform large amount of meaningful experiments. In case of autofluorescence imaging, however, it is difficult to measure lifetime data for a specific fluorophore because there are a lot of endogenous fluorophores in the bio-specimen. As many emission spectra of autofluorescences are overlapped, effective separations of each fluorophore’s spectrum are essential works. So spectral FLIM is utilized to resolve and improve this problem. It provides to measure lifetimes of specific fluorophores exactly. For this reason, it can be useful tool to diagnosis lesions in tissue like arthritis, atherosclerosis, and cancer.
In this thesis, a new type of spectral FLIM implemented by tunable bandpass filter (TBP) is suggested. This system is quite simple above all other spectral FLIM system researched before. Center wavelength which penetrates TBP is varied by incidence angle on TBP. This type of TBP is called angle-tuned bandpass filter(ATBF). So transmission wavelength can be controlled simply by rotating a ATBP which has own bandwidth, 20nm. The specific bandwidth, 20nm, would be limitation when we get spectrally resolved signal. However, this problem can be overcome by using two ATBPs in series. If we set each ATBP’s angle slightly different relatively, bandwidth will be narrower than before. This idea was verified by basic experiment and confirmed to provide high spectral resolution.
To implement FLIM system, time-correlated single-photon counting (TCSPC) method was adopted. The principle of TCSPC was analyzed and this applied to design FLIM system. The basic experiment was fulfilled to confirm a performance of TCSPC and lifetime data of single point of several fluorescence dyes were measured. In the next step, 2D FLIM image was obtained with x, y galvano scanning mirror compatible with TCSPC module. At the end, inserting two TBPs to FLIM system, spectrally resolved data was utilized to separate various fluorophores in specimen and provided good contrast of FLIM image.
형광 수명시간 이미징 현미경(FLIM)은 바이오 시편 등에 대해 기존의 광학 현미경보다 더 많은 정보를 제공해 준다. 형광의 수명시간은 형광 물질에 따라 정해진 정량적인 값으로 형광단의 농도나 레이저의 파워에 무관하게 측정할 수 있다는 장점이 있다. 또한 이 값은 pH, 전하량, 굴절률, 온도 등 주위 환경에 따라 민감하게 변한다. 따라서 형광 수명시간을 측정함으로써 바이오 시편의 주위 환경이 어떻게 변하는 지를 알 수 있다. 그러나 바이오 시편 내에는 다양한 형광 물질들이 공존하고 있어서 생체 내 자체 발광 물질(autofluorescence)에 대한 실험을 할 때 특정 형광 물질의 수명시간을 측정하는데 어려움이 있다. 많은 형광 물질들의 방출 스펙트럼이 겹쳐져 있기 때문이다. 따라서 이를 효과적으로 분리하고 정확한 형광 수명시간 측정을 위해 분광(spectral) 형광 수명시간 이미징이 필요하다.
본 논문에서는 투과 파장 가변 필터(tunable bandpass filter)를 이용한 새로운 형태의 분광 형광 수명시간 이미징 현미경을 설계하고 분석했다. 이 투과 파장 가변 필터는 빛이 입사하는 각도에 따라 투과되는 파장의 특성이 바뀌는 필터이다. 따라서 간단하게 필터를 회전시킴으로써 투과 파장을 조절할 수 있다. 이로 인해 기존의 분광 시스템보다 설계가 용이해진다는 장점이 있다. 그러나 단점으로는 이 필터의 투과 파장 밴드가 20nm로 이를 조절할 수 없다는 것이다. 이를 극복하기 위해 두 개의 필터를 나란히 배치하는 방법을 고안하였다. 만약 두 필터의 각도를 약간의 차이가 나도록 설정한다면 투과 파장 밴드는 더 줄어들 수 있는 것이다. 그러면 다양하게 겹치는 스펙트럼을 더 효과적으로 분리해 낼 수 있다. 기초 실험을 통해 이와 같이 투과 파장 밴드 조절에 대한 검증이 이루어졌다.
형광의 수명시간을 측정하기 위한 방법으로는 시간 상관 단일 광자 계수법(TCSPC)이 이용되었다. TCSPC에 대한 원리를 분석하였고 이를 적용하여 시스템을 구축하였다. 기초 실험으로 형광 물질별로 단일 감쇠 곡선을 측정해 보았고 곡선 맞춤을 통해 형광 수명시간을 계산하고 이를 참고 값과 비교하였다. 다음으로 2D 형광 수명시간 이미지를 얻어 보았고 두 개의 투과 파장 가변 필터를 삽입하여 분광된 형광 수명시간 이미지도 획득하였다. 분광된 데이터를 얻음으로써 두 형광 물질이 효과적으로 분리되는 것을 확인하였고 각각의 수명시간을 측정하는데 정확도를 높일 수 있었다.
