Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most commonly used mammalian hosts for the production of therapeutic proteins. In order to increase the overall product yield, cell death has been vigorously investigated, primarily focusing on type I programmed cell death (PCD), called apoptosis. However, more recently, autophagy has received much attention due to its functionality as a regulator of cell death in the CHO cell culture engineering field. Autophagy, which is also known as type II PCD, is the degradation and recycling process of cellular constituents as part of the bioenergetic management of starva-tion. It is highly related to cell death, cell survival, and cell maintenance. In previous studies, increases of autophagy levels have been observed under various stressful culture conditions. However, the role of autophagy, whether it induces a particular type of cell death or it fights to keep the cells alive under stressful conditions, is controversial.
As a first step, the role of autophagy in CHO cells during serum-free suspension cultures was studied using a representative autophagy inducer, rapamycin, and two CHO cell lines, DG44 and an antibody-producing recombinant CHO (rCHO). In both cell lines, the rapamycin treatment delayed the viability drop and apoptosis induction. In particular, the improved cell viability of the antibody-producing rCHO cell line resulting from the rapamycin treatment led to a 21% increase in the maximum antibody concentration. From observations that a rapamycin derivative, everolimus, demonstrated similar positive effects, but not FK-506, which forms the same complex as rapamycin, but does not inhibit mTOR, it was demonstrated that the posi-tive effects of rapamycin appear to be mTOR-dependent. In addition, the cultivation with rapamycin and/or an autophagy inhibitor, bafilomycin A1, indicated that the autophagy induction is related to the positive effects of rapamycin. The genetic perturbation of the autophagy pathway through the regulation of the expression level of Beclin-1, an important autophagy regulator, resulted in a delayed autophagy induction and apoptosis inhibition in response to the rapamycin treatment. The results obtained in this study imply a positive role for autophagy and predict the usefulness of pro-autophagy engineering in CHO cell cultures.
As a second step, in order to investigate the effect of stressful culture conditions on autophagy as well as apoptosis, sodium butyrate (NaBu), which is a widely used media additive in rCHO cell cultures for high-level expression of therapeutic proteins, was selected for further studies. To determine the effect of NaBu on autophagy as well as apoptosis of rCHO cells, rCHO cells producing erythropoietin (EPO) were subjected to NaBu treatment. NaBu treatment up to 5 mM increased cleaved forms of PARP, caspase-3, and Annexin V positive population, confirming the previous results that NaBu induces apoptosis. Concurrently, NaBu treat-ment increased the level of accumulation of the autophagic marker, LC3-II, independently of nutrient deple-tion, suggesting that NaBu induces autophagy. To elucidate the potential role of autophagy induced by NaBu, rapamycin or bafilomycin A1 was added to cultures together with NaBu. It was found that autophagy had the potential role of a positive cell survival mechanism under NaBu treatment. Furthermore, gradual reduction in mitochondrial membrane potential/mass and recruitment of a mitophagy protein, Parkin, to the mitochondria were observed under NaBu treatment, suggesting that this positive function of autophagy might be mediated by the autophagic removal of damaged mitochondria. Taken together, autophagy was observed in rCHO cell culture under NaBu treatments and the results obtained here support the positive effects of autophagy induced by NaBu treatments. Additionally, the effect of NaBu on autophagy induction in apoptosis pathway engineered rCHO cells was investigated. In a previous study, it was determined that co-down-regulation of caspase-3/7, unlike Bcl-2 overexpression, did not block cell death induced by high concentration of NaBu (3 mM). It was evaluated whether and how autophagy is related to the different outcomes upon NaBu treatments in two apoptosis pathway engineered rCHO cells. Autophagy was induced following the NaBu-induced stress conditions in caspase-3/7 co-down-regulating and Bcl-2 overexpressing cell lines much more than control cells. However, Bcl-2 overexpressing cell lines showed delayed onset of autophagy in a Beclin-1 independent manner, which process showed the fine control of Bcl-2 overexpression on autophagy induction in response to persistent stress conditions. Taken together, the results of our present study provide evidence that autophagy was differentially induced in two different types of apoptosis pathway engineered rCHO cells upon NaBu treatment. In caspase-3/7 co-downregulating cell lines, the autophagy induction did not eventually block the NaBu-induced cell death, and these results suggest that controlled induction of autophagy will be able to effectively block cell death when coupled with anti-apoptosis engineering acting early in the apoptosis pathway, such as through Bcl-2 overexpression.
Based on the previous results, the simultaneous targeting of anti-apoptosis and pro-autophagy was at-tempted by overexpressing anti-apoptotic protein, Bcl-2, and key regulator of autophagy pathway, Beclin-1, to achieve a more efficient protection of CHO cells from stressful culture conditions than solely targeting the apoptosis pathway. Co-overexpression of Bcl-2 and Beclin-1 exhibited longer culture period as well as viabil-ity compared with control and Bcl-2 overexpression, resulting in 2-fold higher integral of viable cell concen-tration (IVCC) than obtained in control during serum-free suspension culture. In addition to the efficient apoptosis inhibition by Bcl-2 overexpression, Beclin-1 overexpression successfully induced the increase in the autophagic marker protein, LC3-II, with the decrease in mTOR activity. By co-immunoprecipitation and qRT-PCR experiments, it was observed that the enforced expression of Beclin-1 increased Ulk1 expression and free-Beclin-1, which did not bind to the Bcl-2 despite the Bcl-2 overexpression. Under other stress conditions such as NaBu treatment and hyperosmolality, co-overexpression of Bcl-2 and Beclin-1 also protect cells from cell death more efficiently than solely overex-pression of Bcl-2, implying the extensive application of autophagy induction.
In conclusion, pro-autophagy engineering efficiently blocked the cell death of CHO cells under vari-ous stressful culture conditions, which resulted in increase of the culture longevity and IVCC. In addition, pro-autophagy engineering can successfully generate a significant synergy effect when coupled with the anti-apoptosis engineering, which has established the efficient anti-cell death strategy of CHO cells.
Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 치료용 단백질 생산을 위해 대표적으로 사용되는 세포이다. 총단백질생산을 증가시키기 위해 세포사멸에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데 현재까지는 이 중에서apoptosis라고 부르는 제1형 세포예정사에만 주로 초점을 맞춰왔다. 하지만 최근들어 autophagy라는 경로가 세포사를 조절할 수 있다는 사실이 밝혀지면서 CHO 세포 공학분야에서의 autophagy 로의 관심이 증가하고 있다. 제2형 세포예정사라고도 불리우는 autophagy는 영양분이 없을 때 세포내부의 에너지를 재생하기 위해 세포 구성성분을 분해하고 이를 재활용하는 경로로서 세포사, 세포 생존, 및 세포 유지에 깊이 연관되어 있다. 많은 이전 연구들에서 다양한 스트레스 배양환경에서 autophagy가 증가한다는 것이 보고되었지만, 이 autophagy경로가 특정한 형태의 세포사를 유도하는 것인지, 스트레스 배양환경에서 세포가 생존할 수 있게 해 주는 것인지에 대해서는 논란의 여지가 많다.
첫단계로, 대표적인 autophagy 유도물질인 rapamycin과 CHO DG44 숙주세포 및 항체 생산 재조합 CHO 세포주를 이용하여 무혈청 부유 배양시 CHO 세포에서의 autophagy의 역할을 알아보았다. 두 종류의 세포에서, rapamycin은 생존율 저하 및 apoptosis 유도를 지연시켰고, 특히 항체 생산 재조합 CHO 세포주에서는 개선된 생존율에 의해 최대 항체 생산을 21% 증가시켰다. Rapamycin의 유도체인 everolimus의 경우 rapamycin과 유사한 효과를 내는 반면, rapamycin과 동일한 복합체를 형성하지만 mTOR는 억제하지 않는 FK-506의 경우에는 효과가 없었고 이를 통해 rapamycin의 긍정적인 효과가 mTOR 의존적임을 보였다. 또한, autophagy 억제물질인 bafilomycin A1을 rapamycin과 동시에 혹은 각각 처리해줌으로써, autophagy 유도가 rapamycin의 긍정적인 효과와 연관되어 있음을 확인하였다. 중요한autophagy 조절자인 Beclin-1의 발현 레벨 조절을 통해 autophagy 경로를 유전적으로 변화시켰을 경우에, rapamycin 처리에도 불구하고 autophagy 유도 및 apoptosis 억제가 지연되는 결과를 얻었고 이를 통해 최종적으로 autophagy가 CHO 세포배양 시에 긍정적인 역할을 한다는 것을 알 수 있었고 autophagy 개량의 유용성을 시사하였다.
두번째 단계로, 스트레스 배양환경이 apoptosis 뿐만 아니라 autophagy에 미치는 영향을 알아보기 위해, 치료용 단백질의 고생산을 위해 CHO 세포배양 시에 많이 사용되는 배지 첨가물인 뷰티르산 염을 이용하여 추후 실험을 수행하였다. 적혈구 생성 촉진 인자 (EPO)를 생산하는 재조합 CHO 세포주에 최대 5 mM까지 뷰티르산 염을 처리할 경우, PARP 및 caspase-3의 분열을 증가시키고 Annexin V 양성 세포군이 증가하였다. 이를 통해, 뷰티르산 염이 apoptosis를 유도한다는 기존의 연구를 검증하였다. 이와 동시에, 뷰티르산 염은 autophagy의 표지인자인 LC3-II의 양을 영양분 고갈과는 독립적으로 증가시켰고 이를 통해 뷰티르산 염이 autophagy를 유도함을 알 수 있었다. 뷰티르산 염에 의해 유도되는 autophagy의 잠재적인 역할을 규명하기 위해, rapamycin과 bafilomycin A1을 뷰티르산 염과 동시에 처리해주었고, autophagy가 잠재적인 세포 생존의 역할을 수행함을 파악하였다. 게다가, 뷰티르산 염 처리에 따른 점진적인 미토콘드리아 막퍼텐셜/양의 감소 및 miophagy (미토콘드리아 특이적 autophagy)단백질인 Parkin의 mitochondria로의 이동을 통해서, 이러한 auotphagy의 긍정적인 효과가 손상을 입은 미토콘드리아의 autophagy에 의한 제거와 연관이 있음을 시사하였다. 이를 통해, 재조합 CHO 세포주에서 뷰티르산 염에 의해 autophagy가 유도되고, 이는 긍정적인 역할을 수행함을 알 수 있었다. 추가적으로, apoptosis 경로가 개량된 재조합 CHO 세포주에서의 뷰티르산 염이 autophagy 유도에 미치는 영향에 대한 연구를 수행하였다. 이전 연구에서, Bcl-2 과발현과 달리 caspase-3/7 동시 저발현은 고농도의 뷰티르산 염 (3 mM)에 의한 세포사를 막지 못함을 보였다. 이번 연구를 통해 이 두 가지 apoptosis 경로가 개량된 재조합 CHO 세포주에서 뷰티르산 염에 대한 autophagy 유도에 어떠한 차이가 있으며, 이것이 어떻게 두 세포주 간 다른 결과를 유도하는 지를 알아보았다. 뷰티르산 염으로 인한 스트레스 조건하에서 대조군 세포에 비해서 caspase-3/7 저발현 및 Bcl-2 과발현 세포주에서 궁극적으로autophagy가 훨씬 많이 유도되었다. 하지만 Bcl-2 과발현 세포주는 Beclin-1에 비의존적인 방법으로 autophagy가 지연 유도되었고, 이를 통해 지속적인 스트레스 조건하에서 Bcl-2 과발현은 autophagy를 조절할 수 있음을 보였다. 본 연구결과를 통해, 두 가지 apoptosis 경로가 개량된 재조합 CHO 세포주에 뷰티르산 염을 처리할 경우 autophagy가 다르게 유도됨을 알 수 있었다. 하지만 궁극적으로 이렇게 유도된 auotphagy는 caspase-3/7 동시 저발현 세포주에서는 세포사를 저해하지 못하였고, 이를 통해 효율적으로 세포사를 막기 위해서는 autophagy가 apoptosis 경로의 상위과정을 조절한 Bcl-2 과발현과 같은 항 apoptosis 개량전략과 연계되야 함을 시사하였다.
기존의 결과를 바탕으로, 항apoptosis단백질인 Bcl-2 및 autophagy 경로의 핵심 조절자인 Beclin-1의 과발현을 통해 apoptosis 억제 및 autophagy 유도를 시도하였고, 이를 통해 apoptosis 경로만 조절한 것보다 더욱 효율적으로 CHO 세포를 스트레스 배양환경에서 보호하기 위한 전략을 수립하였다. Bcl-2 및 Beclin-1 동시과발현은 무혈청 부유 배양시에 대조군 및 Bcl-2 과발현과 비교하여 생존율과 배양 기간을 증가시켰고, 궁극적으로 대조군과 비교하여 누적 세포수를 2배 이상 증가시켰다. Bcl-2 과발현에 의한 효율적인 apoptosis 억제와 더불어, Beclin-1 과발현은 mTOR 활성감소를 동반한 autophagy 표지인자 LC3-II양의 증가를 성공적으로 유도하였다. 공동 면역침강법 (co-immunoprecipitation) 및 정량 리버스 전사 - 중합 효소의 연쇄 반응 (qRT ?? PCR) 실험을 통해, Beclin-1 과발현이 Ulk1의 발현을 증가시키고, Bcl-2 과발현에도 불구하고 Bcl-2에 결합하지 않는 자유로운 Beclin-1의 양을 증가시킴을 보였다. 뷰티르산 염 및 고삼투압과 같은 다른 스트레스 배양환경에서도 Bcl-2 및 Beclin-1 동시과발현은 Bcl-2만 과발현한 것보다 더욱 효율적으로 세포사를 저해하였고, 이를 통해 autophagy 유도가 광범위한 세포사 저해에 응용될 수 있음을 시사하였다.
결론적으로, autophagy를 유도하는 autophagy 개량이 다양한 스트레스 배양환경에서 효과적으로 CHO 세포의 세포사를 막고 배양기간을 증대시켜 누적세포수를 성공적으로 증대시킬 수 있음을 검증하였다. 또한 항 apoptosis 개량과 시너지효과를 창출할 수 있음을 보임으로서 CHO 세포의 효율적인 항세포사전략을 수립하였다.
