Manmade synthetic organophosphates (OPs) have been used as nerve agents and pesticides due to their extreme toxicity and have caused serious environmental and human health problems due to the inhibition of acetylcholinesterase. Hence, effective methods for detoxification and decontamination of OPs are of great significance. In this study, we constructed a genetic circuit system that was based on the transcription activator of phenol catabolism for the directed evolution of organophosphate-degrading enzymes, with the ultimate goal of developing an OP-detoxifying enzyme. The genetic circuit system was composed of the transcription factor DmpR, which is activated by phenolic compounds, and enhanced green fluorescent protein (EGFP), which was used as a reporter protein. In the genetic circuit, phenolic compounds produced from organophosphates by organophosphate-degrading enzymes bind a constitutively expressed DmpR, initiating the expression of EGFP. Thus, the fluorescence intensities of host cells are dependent on the catalytic activity of the enzymes, and the cells expressing organophosphate-degrading enzymes with high catalytic activities were screened by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Methyl parathion hydrolase (MPH) and p-nitrophenyl diphenylphosphate (pNDP) were used as a model enzyme and an analogue of G-type nerve agents, respectively. The utility of the genetic circuit-based screening system was demonstrated by generating a triple mutant with a 100-fold higher kcat/Km than the wild-type enzyme after three rounds of directed evolution. The contributions of individual mutations to the catalytic efficiency were elucidated by mutational and structural analyses. It is believed that the DmpR-based genetic circuit system developed in this study can be effectively used for evolving organophosphate-degrading enzymes with practical applications.
Furthermore, for improving the catalytic activity of OPH and OPAA for degradation of V-type and G-type nerve agents, rational design of OPH and OPAA by remodelling of each substrate binding pocket was performed. As a result, we obtained the OPH mutant with 5.1-fold increased degradation activity for VX than standard OPH showing 26-fold increased activity for VX than wild-type OPH. And the OPAA mutant having 14.4-fold, 3.2-fold, and 1.7-fold improved activities for GB, GD, and GA was developed by remodelling of substrate binding pocket. The broadened substrate binding pocket contributes to increase catalytic activity for hydrolysis of nerve agents of organophosphate-degrading enzymes. The mutants of OPH and OPAA with improved catalytic activities can be eco-friendly used in the military for decontamination and detoxification of OP nerve agents as well as in the decontamination of pesticides contaminated areas.
독성 유기인 화합물은 체내에서 acetylcholinesterase(AChE)의 활성을 저해하여 생리작용 및 신경전달을 방해하여 독성을 나타내게 되고 심하게 되면 사망에 이른다. 현재까지 1500개 이상의 서로 다른 유기인 화합물이 합성되었다고 알려져 있고, 대다수의 유기인 화합물들은 살충제 등의 농약으로 사용되고 있으나, Sarin, Soman, VX, Tabun 등의 화합물들은 신경 작용제로서 화학 무기로 널리 개발??사용되고 있다. 따라서 화생방전 및 생화학 테러에 대비한 제독제의 개발이 요구되는 실정이다. 유기인 농약 및 화학무기들은 기존의 물리적??화학적 방법에 의하여 처리할 때 상당한 비용 소모와 환경오염이 수반되므로 새로운 처리기술, 특히 생물학적 복원(Bioremediation) 방법의 개발이 요구되고 있다. 그 중에서도 친환경 효소들을 이용한 방법들이 조명을 받고 있다. 특히 미생물 유래의 Organophosphorus Hydrolase (OPH), Organophosphorus Acid Anhydrolase (OPAA), Methyl parathion hydrolase (MPH) 등의 효소들이 유기인 화합물들을 효과적으로 가수분해한다고 알려져 있다. 이러한 효소들은 생물학적 복원제 및 제독제로서 그 이용 가능성에 대하여 상당한 관심을 받고 있지만, 실제 현장 적용에서는 효소의 구조적 안정성과 높은 촉매 효율이 요구되고 있다. 이를 위하여 본 연구에서는 분자진화 및 합리적 설계를 통하여 유기인 분해효소 개량체를 개발하고자 하였다.
유기인 화합물 분해효소 개량체 개발을 위하여 먼저 페놀 감응 전사인자인 DmpR 과 EGFP로 구성된 페놀 분해작용 전사활성인자 기반의 유전체 회로를 구축하였다. 이 유전체 회로는 유기인 화합물 분해효소 활성에 의한 분해산물인 페놀 물질들이 상시 발현되는 DmpR과 결합하여 EGFP의 발현을 유도하게 된다. 따라서 활성이 증대된 효소에 의해 높은 형광값이 유도되고, 고 형광을 갖는 고 활성의 세포는 초고속유세포분석기 (fluorescence-activated cell sorting (FACS))을 통하여 선별할 수 있다. 상기 유전체 회로의 유용성을 검증하기 위해 methyl parathion hydrolase (MPH) 와 p-nitrophenyl diphenylphosphate (pNDP)를 이용한 분자진화를 수행하였고, 3차례의 분자진화의 결과 pNDP기질에 대하여 kcat/Km 기준 최종 100배의 활성이 증대된 개량체를 선별하였다. 따라서 개발한 DmpR 기반의 유전체 회로 시스템은 유기인 분해효소의 개량체 개발에 효과적인 시스템이라고 할 수 있다.
또한 V 계열 및 G 계열의 유기인 신경작용제 분해를 위한 고기능 효소 개량체 개발을 위하여, OPH 및 OPAA의 활성부위의 합리적 설계를 수행하였다. 그 결과, 기존의 야생OPH보다 VX에 대하여 상대적으로 26배 증대된 활성을 갖는 standard OPH에 비해 kcat/Km 기준 VX 분해능이 5.1배 증대된 OPH를 개발하였다. 한편, G계열 작용제에 대해서 kcat/Km 기준 Sarin에 대해 14.4배, Soman에 대해 3.2배, 그리고 Tabun에 대해 1.7배 증대된 활성을 지닌 OPAA 개량체를 개발하였다. OPH 와 OPAA의 개량체를 통하여 활성부위 입구의 확장이 유기인 분해효소의 신경작용제 분해활성 증대에 기여함을 확인하였다. 고 기능의 유기인 분해효소 개량체들은 군용 유기인 신경작용제의 친환경 제독제 및 정화제로 이용 가능할 뿐 아니라 민수용으로는 농약 오염지역의 정화제 등으로 다양한 활용 가능성을 지닌다.
