The yeast heterodimeric Mus81-Mms4 complex possesses a structure-specific endonuclease activity that is critical for the restart of stalled replication forks and removal of toxic recombination intermediates. Previously, we reported that Mus81-Mms4 and Rad27 (yeast FEN1, another structure-specific endonuclease) mutually stimulated their nuclease activity. In this report, we investigated the interactions between human FEN1 and MUS81-EME1/EME2, the human homologs of yeast Mus81-Mms4 complex. We report that both MUS81-EME1 and MUS81-EME2 increased the activity of FEN1, while FEN1 did not stimulate the activity of MUS81-EME1/EME2. The MUS81 subunit alone and its N-terminal half were able to bind to FEN1 and stimulate its endonuclease activity. A truncated FEN1 fragment devoid of the C-terminal region that still retained its catalytic activity, was not stimulated by MUS81. Michaelis-Menten kinetic analysis revealed that MUS81 increased the interaction between FEN1 and its substrates (KM) of FEN1 and increased the Kcat three to four fold. We also showed that following DNA damage in human cells, FEN1 is co-localized with MUS81. These findings indicate that the human proteins and the yeast homologs act similarly, except that the human FEN1 does not stimulate the nuclease activities of MUS81-EME1 or MUS81-EME2. Thus, the mammalian MUS81 complexes and FEN1 collaborate to remove various flap structures that arise during many DNA transactions including Okazaki fragment processing.
효모의 Mus81-Mms4 복합체는 정지된 복제 분기점의 재시작과 유독성 재조합 중간 산물의 제거에 중요한 역할을 하는 구조 특이적 endonuclease 이다. 우리는 이전의 연구를 통해Mus81-Mms4 와 Rad27 (효모에서의 FEN1) 이 상호 활성 증진 관계에 있음을 발표하였다. Rad27 은 DNA 복제 도중에 형성되는 오카자키 단편의 처리와 다른 복구 과정에 참여하는 또 다른 구조 특이적인 endonuclease 이다. 본 논문에서는, 이들의 인간 상동 효소인 FEN1 과 MUS81-EME1/EME2 사이의 기능적 상호작용에 대해 연구하였다. 우리는 MUS81-EME1 과 MUS81-EME2 모두가 FEN1 의 활성을 증진시킨다는 사실을 확인하였다. 그러나 효모에서와는 다르게, 인간 FEN1 은 MUS81-EME1 이나 MUS81-EME2 의 활성을 증가시키기 못한다는 결과를 얻었다. MUS81-EME1/EME2 복합체는 단일 단위 단백질인 MUS81 만으로도 FEN1 의 활성을 증가시킬 수 있었으며, MUS81 의 N-terminal 절반부분이 FEN1 과의 결합과 활성 증진에 필요 충분한 지역임을 확인하였다. C-terminal 의 3분의 1 가량이 제거된 돌연변이 FEN1 을 제작하여 실험한 결과, 여전히 효소적 활성은 가지고 있었지만 MUS81 에 의해 활성이 증가되지는 않았다. 이러한 결과들은 MUS81 복합체가 FEN1 의 활성을 증진하기 위해서는 단백질들간의 직접적인 상호작용이 필수적임을 의미한다.
Michaelis-Menten kinetic 분석 실험을 통해 우리는 MUS81 이 substrate 에 대한 FEN1 의 KM 값을 감소시키며 Kcat 값을 4-5 배 가랑 증가시킴을 알 수 있었다. 추가적으로, DNA 에 손상이 발생하였을 경우 FEN1 이 MUS81 과 동일한 곳에 위치함을 (co-localization) 발견하였다. 인간에서 FEN1 에 의해 MUS81-EME1 또는 MUS81-EME2 의 활성이 증가되지 않는다는 사실만 제외하면, 인간 단백질들을 사용하여 도출한 실험 결과들은 효모의 단백질들을 사용하여 얻은 정보들과 일치하였다. 본 연구를 통하여, 우리는 포유류MUS81 복합체와 FEN1 이 오카자키 단편의 처리와 같은 수많은 DNA 대사과정에서 생성되는 다양한 flap 구조들을 제거하기 위해 협력하여 기능하는 것이 여러 종에서 보편적으로 받아들여질 수 있는 이론이라는 것을 제안한다.
