Alternatives binding scaffold has driven much attention because antibodies have some drawbacks despite a widespread use in biotechnology and biomedical fields. In an effort to develop an alternative scaffold, we have focused on repeat proteins for binding affinity design and developed as a next-generation binding scaffold with ideal biophysical properties. Leucine-rich repeat (LRR) modules with unique framework sequence assemble in a similar pattern to other repeat proteins, forming a horseshoe shaped, solenoid fold. We analyzed the structure of repeat proteins to develop the design method and demonstrated the successful design with TV3 protein composed of LRR module based on the rational approach. Based on the analysis of the TV3 crystal structure complexed with MD2, we designed mutants to increase binding affinity for MD2 and revealed the overall structural rigidity and the contribution of designed residues in high binding affinities. To demonstrate the development of a new scaffold protein, we presented the design of a new binding scaffold based on repeat protein, variable lymphocyte receptors (VLRs), by module engineering. We designed the N-terminal domain of VLR and successfully developed as a new scaffold with ideal properties such as high expression level in bacteria system, high stability, and designability toward various targets. Lastly, we attempted to find an alternative scaffold having the similar structural properties of antibodies. Among these structural properties of antibodies, it is considered that the interaction mediated through flexible CDR loops of antibodies is the key feature of antibody scaffold for high affinity toward various targets. We demon-strated EC1, the first domain of human E-cadherin, has the potential as a new binding scaffold to overcome the drawback of antibodies and presented the desirable properties, including the design of new binding mole-cules based on EC1 scaffold. These newly designed proteins can be a promising scaffold for the development of molecular binders with biomedical and biotechnological applications.
현재 가장 널리 사용되고 있는 항체 골격 기반의 결합 단백질들은 높은 생산 단가, 큰 분자량, 지적 재산권 문제 등이 그 활용에 있어 단점으로 지적되고 있다. 이러한 항체 골격 단백질의 한계를 극복하기 위한 노력으로 새로운 단백질 골격을 개발하고 이를 바탕으로 결합 단백질을 설계, 생산하려는 시도가 활발히 이루어지고 있다. 기본 모듈이 반복되어 이루어지는 반복 단백질의 특징 분석을 통해 새로운 단백질 골격으로 개발하고 이를 기반으로 다양한 결합 단백질을 설계, 활용하기 위한 연구를 수행하였다.
제 1장에서는 반복 단백질 중 하나인 TLR4 기반 단백질에 대해 구조 분석을 통한 합리적 설계 방법을 통해 패혈증 관련 주요 인자인 MD2에 대한 높은 결합력을 갖는 변이체들을 설계하였다. 기존의 결합력을 증가 시키거나 새로운 결합력 생성을 유도하는 설계 전략을 통해 하나의 변이를 통해서도 10배 이상의 결합력이 증가된 변이체들을 다수 확보하였다. 또한, 이러한 변이들의 조합을 통해 근접한 모듈에 위치한 변이들이 쌍을 이룰 경우 더 높은 결합력 향상을 야기한다는 사실을 발견하였다. 이를 통해 반복 단백질 설계에 널리 활용될 수 있는 합리적 설계 방법을 구축하였고, 높은 결합력을 갖는 패혈증 치료제 후보 물질을 확보하였다.
제 2장에서는 무악류에 존재하는 VLR이라는 단백질을 기반으로 신규 골격 단백질을 설계하였다. 발현량 및 안정성 증대를 위해 데이터 베이스의 서열분석과 인터날린 단백질과의 결합형태 설계를 통해 신규 단백질 골격을 확보하고 이를 Repebody라 칭하였다. 신규 단백질 골격의 높은 발현양 및 열적, 화학적 안정성을 검증하였으며, 다양한 타켓에 대해 효율적인 합리적 설계가 가능함을 보여 주었다. 이를 통해 안정적으로 박테리아 시스템을 통해 고효율적 생산이 가능한 신규 단백질 골격 및 이를 기반으로 한 결합 단백질을 다수 설계, 확보하였다.
제 3장에서는 항체와 비슷한 구조를 가지고 있는 인간 유래cadherin 단백질의 첫 번째 도메인을 활용하여 그 특성을 규명하고 새로운 단백질 골격으로의 가능성을 확인하였다. 안정적으로 많은 양이 발현되는 생산조건을 구축하고, 도메인간의 연결을 통해 다수의 타켓에 결합할 수 있는 다수 결합 형태로 설계 후 이의 구조적 안정성을 검증하였다. 또한 이러한 골격 단백질을 기반으로 한 결합 단백질의 설계에 기존 항체 연구에 널리 활용되던 라이브러리 제작과 파지를 활용한 선별 방법이 적용될 수 있음을 확인하였다.
위의 연구들을 통해 원천성을 갖는 신규 골격 단백질들을 확보하고 이를 기반으로 한 다양한 결합 단백질을 설계, 확보하였으며 이는 산업 및 의약 분야에 널리 활용 될 수 있을 것으로 기대된다.
