This thesis presents a cell chip for the formation, the pumpless perfusion culture, and the comparative drug-response analysis of two-dimensional (2D) cell layers and three-dimensional (3D) cell spheroids. Multi-cellular drug resistance (MCR), one of key indexes in cell-based drug screening, is measured by comparing the response of 2D and 3D cell models to drugs at the same environments. The previous cell chips, however, cannot form 2D layers and 3D spheroids in an identical structure, thus being difficult to compare the drug-response from 2D and 3D cell models. In addition, the bulky fluidic pumps required for medium perfusion in the previous work make it difficult to be a compact integrated chip. The present cell chip obtains MCR properties by comparing the drug-response of 2D and 3D cell models formed in an identical structure and cultured at the same environments. The present cell chip also achieves simple and low-cost perfusion cell culture based on the balanced droplet dispensing without requiring bulky fluidic pumps.
The cell chip consists of two Polydimethylsiloxane (PDMS) layers: a well layer and a droplet dispenser layer. The well layer has a 4×8 array of 6mm-diameter wells, where 8 wells in each row are connected to a common drain port through drain channels. The droplet dispenser layer is placed on top of the well layer to supply fresh medium droplets to the wells. When we incubate cells in the chip placed upright, the cells adhere to the well bottom and cluster in 2D layers. On the other hand, when we place the cell chip upside down, the cells aggregate each other in suspended medium droplets and form 3D spheroids. After the cell model formation, we culture the cells at the constant medium perfusion rate using the pumpless droplet dispensing balanced between well-inlet and drain-outlet. The cell chip was fabricated from the PDMS molding and bonding processes.
In the experimental study, we demonstrated the cell chip successfully forms 3D spheroids in the diameter range of 220μm~3.2mm (uniformity > 90%) using H358, H23, and A549 human lung cancer cells. In the spheroid culture test, the constant perfusion rates, Q, of the balanced droplet dispensing were adjusted as 0, 0.1, 0.2, and 0.3μl/min with the deviation and the error less than 9.96% and 6.92%, respectively. At the perfusion culture (Q=0.1~0.3μl/min), the proliferation rates of H358 cells increased up to 50% from the static culture (Q=0μl/min) and the viability of the cultured cells had also increased about 10%. This suggests that the perfusion culture provided more favorable culture environments to cells than the static culture by facilitating the efficient nutrients supply and waste product removal. In the drug-response analysis, we measured the MCR indexes of 3.09, 6.03, and 11.3 by comparing the response to an anti-cancer drug, cisplatin, for the 2D and 3D models formed of 103, 5×103, and 104 H358 cells, respectively. This suggests that the H358 cells in the 3D spheroid model become resistant to the cisplatin due to the multi-cellular aggregation effect.
In this thesis, we have designed, fabricated, and characterized the cell chip for the formation, the pumpless perfusion culture, and the comparative drug-response analysis of 2D cell layers and 3D cell spheroids. The present cell chip has potential for use in cell-based drug screening.
본 연구에서는 이차원 세포층 및 삼차원 세포군집의 형성, 펌프 없는 관류배양 및 약물반응 비교분석이 가능한 세포칩을 제안하였다. 최근 항암제 스크리닝 분야에서 이차원과 삼차원 세포모델의 약물반응 비교 분석을 통해 세포군집에 따른 항암제 저항특성 (Multi-cellular drug resistance, MCR)을 분석하는 연구가 중요시되고 있다. 하지만, 기존의 세포칩은 동일한 구조 내에서 이차원 세포층과 삼차원 세포군집을 형성할 수 없어 약물반응 비교 분석을 통한 MCR 특성 관찰이 어려웠다. 뿐만 아니라 기존의 세포칩은 관류 세포배양을 위해 복잡한 유체펌프를 필요로 하여 집적화된 세포배양 시스템에 적용되기 어려운 한계가 있었다. 이에, 본 연구에서는 동일한 구조 내에서 이차원과 삼차원 세포모델을 형성하고 그 약물반응을 비교 분석함으로써 MCR 특성을 용이하게 관찰할 수 있는 세포칩을 제안하였다. 아울러, 제안된 세포칩은 배양액 액적의 균형공급을 이용하여 펌프 없이 간단한 구조로 관류 세포배양이 가능한 장점이 있다.
제안된 세포칩은 Polydimethylsiloxane (PDMS) 소재의 웰 층과 액적 공급 층으로 구성되어 있다. 웰 층에는 6mm 지름의 웰이 4×8로 배열되어 있으며, 각 행의 8개 웰은 배수유로를 통해 배수구로 연결되어 있다. 웰 층 상단에는 액적 공급층을 두어 각 웰에 배양액 액적을 공급할 수 있도록 하였다. 제안된 세포칩의 웰에 세포를 주입한 후 칩을 똑바로 두면 세포가 웰 바닥에 부착되어 이차원 세포층을 이루고, 칩을 거꾸로 두면 세포가 서로 결집되어 삼차원 세포군집을 형성한다. 세포모델 형성 후, 웰과 배수구 간의 액적 균형공급을 이용하여 펌프 없이 간단한 구조로 관류 세포배양이 가능하며, 이차원과 삼차원 세포모델의 항암제 반응을 비교 분석함으로써 암세포의 MCR 특성을 관찰할 수 있다. 제안된 세포칩은 PDMS 몰딩 및 접합 기법을 이용하여 제작되었다.
H358, H23 및 A549 폐암 세포주를 이용한 실험결과, 제안된 세포 배양칩이 90% 이상의 균일도로 220μm~3.2mm 크기의 삼차원 세포군집을 형성 가능함을 확인하였다. 또한, 액적 균형공급을 이용하여 각각 9.96% 및 6.92%의 웰 간 편차 및 이론값과 실험값 간 오차 내에서 0~0.3μl/min 범위의 배양액 관류유량을 얻음을 확인하였다. 아울러, 0.1, 0.2 및 0.3μl/min의 관류배양에서 삼차원 H358 세포군집이 0μl/min의 정치배양보다 최대 50% 이상 증가된 증식률과 최대 10% 이상 증가된 활성도를 보임을 확인하였다. 이는 관류배양의 경우 양분 공급과 노폐물 제거가 원활하여 H358 세포에 보다 좋은 배양환경을 제공하였기 때문으로 판단된다. 103, 5×103 및 104개의 H358 세포로 형성된 이차원 세포층 및 삼차원 세포군집의 Cisplatin 항암제 반응을 비교 분석한 결과 각각 3.09, 6.03 및 11.3의 MCR 특성을 관찰하여 삼차원 세포군집 내의 H358 세포가 세포 간 군집효과에 의해 Cisplatin에 대한 저항성을 가짐을 확인하였다.
본 연구에서는 이차원 세포층 및 삼차원 세포군집의 형성, 펌프 없는 관류배양 및 약물반응 비교분석이 가능한 세포칩을 제안하고 그 성능을 검증하였다. 제안된 세포칩은 향후 세포 기반의 항암제 스크리닝에 적용 가능하다.
