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Development of electrochemical biosensor for methyltransferase activity assay utilizing quantum dot = 양자점을 이용한 메틸전달효소 활성 분석용 전기화학적 센서 개발
서명 / 저자 Development of electrochemical biosensor for methyltransferase activity assay utilizing quantum dot = 양자점을 이용한 메틸전달효소 활성 분석용 전기화학적 센서 개발 / Song-Yi Baek.
저자명 Baek, Song-Yi ; 백송이
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2011].
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초록정보

DNA methylation catalyzed by methyltransferase (MTase) is a significant epigenetic process for regulating gene expression in gene transcription, embryogenesis, and diseases. Recent studies have demonstrated that aberrant methylation is a new generation of cancer biomarkers, and can be regarded as a hallmark of various diseases, cancer in particular. Moreover DNA MTases have been regarded as a novel family of pharmacological targets for treatment of tumors and the inhibition of MTases may provide a broad spectrum of antimicrobial applications like MTase inhibitors screening or discovery of anticancer drugs. Traditional methods to study MTase activity are laborious and insensitive. Herein, a new electrochemical method for the analysis of methyltransferase activity without any washing-step was developed based on enzymatic methylation/cleavage coupling reaction utilizing quantum dot as a signaling tracer. On the gold matrix immobilized with thiolated ssDNA, biotin-modified complementary strand and streptavidin-coated CdSe/ZnS QDs were successively reacted resulting in QD tethered dsDNA. Then, various concentration of DNA adenine methylation (Dam) MTase was applied which generated methylated sequence (GAmTC) in dsDNA. For the signaling, DpnI was applied to the methylated dsDNA to specifically cleave the methylated site generating free QD which could be detected by anodic stripping voltammetry. As increasing amount of methylated DNA, electrochemical signal generated from QD increase because the amount of free QDs increase. As a result, MTase activity can be simply detected with high sensitivity, selectivity, wide linear range (1-160 U/mL) and a low detection limit (1 U/mL) by our washing-free electrochemical method. We confirmed operation of our system utilizing AFM. Furthermore, this study could be easily expanded to assay of genomic DNA methylation level and evaluation and screening of the inhibitors of methyltransferase.

DNA 메틸화는 유전자 발현을 조절하여 세포의 기능을 조절하는 중요한 후성유전학적 과정으로, DNA 메틸전달효소에 의해 촉진되며 원핵생물와 진핵생물 모두에서 나타난다. DNA 메틸화는 DNA 메틸전달효소가 특정 염기서열을 인식하고 S-아데노실-L-메티오닌으로부터 메틸기를 전달받아 표적 사이토신이나 아데닌에 메틸기를 공유결합시키는 과정이다. 비정상적인 DNA 메틸화는 DNA가 단백질로 전사 및 번역 과정에 영향을 주며 최근의 연구에서 비정상적인 DNA 메틸화는 새로운 암 생물지표로 인식되고 있으며 DNA 메틸전달효소는 항암치료의 잠재적 약리학적 표적으로 주목받고 있다. 따라서 DNA 메틸화를 분석하거나 DNA 메틸전달효소의 활성을 빠르고 민감하게 분석하는 바이오센서가 필요하다. 본 연구를 통해 고안된 DNA 메틸전달효소의 활성 측정을 위한 전기화학적 분석방법은 전기화학적 신호를 위하여 양자점을 사용하였고 메틸전달효소와 핵산내부절단효소의 작용을 기반으로 하였다. 먼저 금 기저에 타이올화시킨 단일가닥을 고정화 하고, 그와 상보적인 염기서열을 가진 바이오틴이 붙은 단일가닥을 혼성화 시킨다. 그리고 스트렙타아비딘이 코팅된 양자점을 넣어 바이오틴과 결합하게 한 후 세척과정을 거치면 DNA 메틸전달효소의 활성을 측정할 수 있는 기본 기질-양자점이 결합된 이중가닥-이 마련된다. GATC서열을 포함하고 있는 양자점이 결합된 이중가닥은 DNA 아데닌 메틸화 (Dam) 효소에 의해 메틸화(GAmTC)가 되고 메틸화된 GATC서열만을 인식하는 DpnI 핵산내부절단효소에 의해 이 부분이 잘려나가게 된다. 이 때, 금 기저에 고정화되어있던 양자점이 용액상에 있게 되고 이것은 양극벗김전압전류법(anodic stripping voltammetry)에 의해 검출된다. 반면에 Dam 효소가 존재하지 않거나 활성이 없는 경우엔 이중가닥이 메틸화가 되지 않고, 또한 DpnI 핵산내부절단효소가 이를 인식하고 자르지 못하므로 양자점은 계속 고정화된 상태로 있게 되어 신호가 나오지 않는다. 양자점이 두 효소의 작용에 의해 검출될 수 있는 상태로 잘려나오는 것을 원자간력현미경(Atomic Force Microscope)을 통하여 증명하였다. 그리고 다른 염기서열을 인식하여 메틸화시키는 EcoRI 메틸전달효소와 비교하여 봤을 때 DNA 아데닌 메틸전달효소에만 특이적으로 작용하였고, DpnI 핵산내부절단효소만 넣은 통제 신호와 비교하여 봤을 때 33배 높은 신호를 보였다. 또한 DNA 메틸전달효소의 활성을 정량하기 위해 같은 조건에서 Dam 효소의 농도만 달리하고 실험을 진행하였다. 메틸화되는 DNA의 양이 증가할수록 양자점이 결합된 DNA가 더 많이 잘려나오고, 양자점으로부터 발생한 전기화학적 신호가 증가함을 보였다. 이는 이전의 방법들과 비교하여 보았을 때, 1-160 U/mL의 넓은 검출범위와 낮은 검출한계를 가진 효과적인 방법임을 증명하였다. 마지막으로 DNA 메틸전달효소 억제작용을 분석해보았다. 비정상적인 DNA 메틸화는 암을 유발할 수 있으므로, DNA 메틸전달효소 억제작용은 항암치료를 위한 잠재적인 효과를 가지고 있다. 본 분석방법을 통하여 억제제에 의해 DNA 메틸화가 억제되는 것이 효과적으로 검출됨을 보였다. 본 연구에서 고안된 빠르고 높은 민감성과 선택성을 가진 전기화학적 분석방법은 DNA 메틸화 정도, DNA 메틸전달효소 활성 및 항암약물 검사에 사용될 수 있으며, 더 나아가 새로운 메틸전달효소 분류, 핵산내부절단효소 분석, 및 새로운 항암약물 분류에 적용될 수 있다. 또한 양자점을 기반으로 한 전기화학적 방법을 통하여 한번에 다양한 메틸화정도를 분석하거나 다양한 메틸전달효소의 활성을 측정할 수 있을 것으로 예상된다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {MCBE 11022
형태사항 vii, 40 p : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 백송이
지도교수의 영문표기 : Hyun-Gyu Park
지도교수의 한글표기 : 박현규
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p.30-34
주제 DNA methyltransferase
electrochemical biosensor
quantum dot
DNA메틸전달효소
전기화학센서
양자점
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