Due to high specificity and affinity to target antigen, immunoglobulin G (IgG) antibody has been considered as the most important therapeutic proteins. However, because of glycosylation, most antibody therapeutics have been produced in mammalian hosts and these cause the high cost and poor supply to patients. Even though recent development of aglycosylated antibodies which have effector functions without glycosylation allows the use of E. coli as a host cell for antibody production, still the poor expression and inefficient assem-bly of IgG in E. coli is remained as a problem to be solved. In this study, we developed the host-vector system for the efficient production of recombinant IgG against anthrax toxin PA. First, several E. coli strains were examined to choose the proper host strain, and different promoters and leader peptides were also examined for the efficient secretion of both heavy and light chains into periplasm of E. coli. Then co-expression of various factors like as periplasmic chaperones and foldases and component related with SRP pathway were examined to improve the assembly of both chains into full-length IgG in periplasm. The final engineered E. coli strain was able to produce IgG with a 62 mg/L by fed-batch culture. The approaches described in this study can be applicable to development of strains for the efficient production of other large size protein or valuable bioproducts.
최근 합성신약의 특허만료와 부작용으로 인하여 바이오 의약품이 주목 받기 시작하였으며 특히 항체의약품은 시장규모의 증가로 인하여 그 중요성이 더욱 커지고 있다. 따라서 항체의 원활한 공급을 위한 효율적인 생산시스템 연구의 필요성이 제기되고 있는 상황이다. 현재 항체의약품은 mammalian cell cultivation을 통하여 생산되고 있으나, 이는 시간이 오래 걸리고 값이 비싼 media를 이용해야 하는 단점을 갖고 있다. 따라서 대장균을 이용한 항체의 대량생산은 생산시간을 줄이며 경제적 비용을 줄일 수 있는 대안이 될 수 있다. 이번 연구에서 우리는 탄저병을 일으키는 원인이 되는 탄저균의 독소에 대한 항체를 생산에 사용하였으며, 생산성을 증대시키기 위하여 항체의 각 chain들의 secretion과 assembly라는 측면에서 접근하였다.
항체의 대량생산에 효율적인 균주를 선별해내는 과정으로 총 4 종류의 균주에서 실험을 진행하였으며, XL1-Blue에서 가장 높은 발현율을 확인하였다. 그 후에 promoter와 signal peptide에 따른 assembled IgG의 발현양을 확인하면서 최적의 항체 발현 벡터를 제작하였다.
또한 IgG의 assembly를 증대시키기 위하여 기존에 알려진 foldase와 chaperone을 co-expression시키는 방법으로 최적의 candidate를 찾게 되었으며, DsbC foldase를 함께 발현시켰을 경우 활성이 있는 IgG의 양이 약 9~10배 증가된 것을 확인하였다. 이는 기존에 알려진 foldase의 co-expression의 효과가 대장균내의 IgG생산에 있어서도 긍정적으로 작용한다는 것을 암시해준다.
Secretion의 효율을 높이고자 SRP pathway에 관여하는 Ffh와 FtsY를 co-expression시켜주어 그 영향을 살펴 보았다. Ffh는 SRP(signal recognition particle)를 구성하는 단백질로써 과 발현 시켰을 경우 DsbA signal peptide에 bind하여 FtsY로 ribosome과 protein의 complex를 가져다 주는 역할을 하기에 secretion을 증진시킬 것으로 기대하였다. 그 결과 secretion의 양이 증가되는 data를 얻을 순 없었지만, antigen binding assay로 active한 IgG의 양이 3배 가량 증가됨을 알 수 있었다. 2D분석을 통하여 전체적인 단백질의 발현양상을 살펴본 결과 몇 종류의 단백질의 발현양상이 변화함을 확인할 수 있었기 때문에 Ffh가 단지 secretion에만 관여하지 않고, 대장균 세포내의 다른 단백질의 변화에도 영향을 주어 결과적으로 IgG생산에 긍정적인 영향을 준 것으로 예상된다.
Secretion과 assembly에서 각각 찾아낸 DsbC와 Ffh를 한 종류의 벡터로 발현되는 시스템을 제작하여 기존에 각자 발현되던 시스템과 비교한 결과 assembled IgG의 생산이 더 증진되었기에 이 시스템으로 fed-batch fermentation을 진행하였다. Fed-batch fermentation은 induction후 온도의 변화 (30 °C, 25 °C)와 induction하는 세포의 density를 달리하여(O.D600 30, OD600 60, OD600 120) IgG의 생산량의 변화를 살펴보았으며, O.D600 60에서 induction하여 25 °C에서 발현하는 조건에서 가장 높은 volumetric productivity (2.21 mg/L/h)를 얻을 수 있었다.
이는 기존에 발표되었던 대장균을 이용한 항체 생산과 비교하였을 때 처음으로 assembly 뿐 아니라 secretion을 동시에 해결하고자 접근하였던 점, 발효의 최적화 그리고 시간의 단축으로 기존과 비슷한 수준의 생산성을 갖는다는 점에서 의의가 있다. 따라서 이 연구는 세포공학적 기술을 이용하여 대장균에서 고부가가치 산물을 생산하는 방법을 제공하였으며, 비교적 크기가 큰 단백질을 생산하는 시스템의 모델로써 적용해볼 수 있는 가능성을 제공하였다는데 그 가치가 있다.
