Escherichia coli is an important microbial indicator of fecal contamination, and some strains are pathogenic. Therefore, accurate quantitative detection of E. coli is one key to ensuring public health. In this study, a microbial fuel cell (MFC) was used as the detection unit of an E. coli sensor, and specific enzymes expressed in E. coli, such as β-D-galactosidase (GAL) and β-D-glucuronidase (GUS), were exploited as biological detection elements. As substrates, 4-aminophenyl-β-D-galactopyranoside (4-APGal) was used for GAL detection, and 8-hydroxyquinoline glucuronide (8-HQG) and 4-nitrophenyl β-D-glucuronide (PNPG) was used for GUS detection. Once hydrolyzed by GAL or GUS, these substrates became electrochemically active products that were then oxidized on the anode of the MFC reactor. In this way, the power output of the MFC reactor increased sharply when E. coli in the reactor reached to the critical bacterial concentration. The time required to reach the highest voltage output was recorded as a detection time (DT), and a negative linear relationship was found between DT and the logarithm of initial concentration of E. coli in the samples studied. DTs of laboratory samples were 140 min and 560 min for initial concentrations of 1.9×107 CFU/mL and 42 CFU/mL, at 44.5 oC, respectively, and remained almost the same regardless of substrate. DTs for GUS assays were further shortened by induction with methyl β-D-glucuronide sodium salt (MetGlu). The quantitative relationship between DTs and initial E. coli concentrations, as established from replicate laboratory sample assays, allowed estimation of the E. coli concentration in environmental samples, but only with approximately 250 min of lag time.
Second part of this study was conducted to reduce the lag time (delayed MFC response) that possibly caused by dormant cells in the samples, and to find a simple way of in situ sterilization of a once-used sensor unit for reuse. These two issues needed to be solved for the sensor to achieve more rapid and accurate quantification, thereby improving field applicability. To this end, we attempted to awaken and thereby decrease the lag time of dormant E. coli cells by means of various physical and chemical stimuli. Dormant E. coli cells were artificially prepared by starvation to mimic environmental cells, whose prolonged lag time (max. 230 min) and morphological changes were examined. To shorten the lag time of dormant cells, various approaches, such as agitation, the addition of nutrients or metabolic intermediates, and enzyme induction, were tested. Among them, the addition of pyruvate, one of key intermediates that enable organics to shunt into the TCA cycle and also an intermediate of glycolysis, was found to reduce the lag phase by up to 130 min and the doubling time by about 2 min. We also developed an in situ disinfection method to sterilize used reactors via so-called in situ electrochemical disinfection. For that, direct electrochemical oxidation was employed and found to be effective at 8 V of direct current (DC) for an hour with the 0.05 M sodium sulfate solution as an electrolyte.
대장균은 분변 성 오염 측정의 중요한 지표균이자, 종에 따라 인체에 유해한 병원균이기도 하다. 그러므로 빠르고 정확한 대장균의 정량적 검출은 국민 보건을 위해서 매우 중요하다. 이 연구에서는, 미생물 연료전지를 대장균 검출 센서의 측정 단위로 사용하였으며, 대장균이 지닌 특정한 효소인 β-D-galactosidase (GAL) and β-D-glucuronidase (GUS)를 검출 요소로 이용하였다. 기질로는 GAL 검출을 위해서는 4-aminophenyl-β-D-galactopyranoside (4-APGal)이, GUS 검출을 위해서는 8-hydroxyquinoline glucuronide (8-HQG) and 4-nitrophenyl β-D-glucuronide (PNPG)이 사용되었다. 위의 기질들은 효소 GAL 이나 GUS에 의해 전기화학적 특성을 띠는 물질로 분해되며, 연료전지의 음극에서 산화된다. 이와 같은 방법으로 연료전지는 대장균이 측정 가능한 농도에 다다르면 급격한 전압 증가 현상을 보인다. 전압 증가가 최고치에 이르기 까지 걸리는 시간을 측정시간(DT) 로 기록하였으며, 대장균의 초기 농도의 대수 값과 측정 시간 사이에 역 선형 관계를 발견하였다. 실험실 샘플의 측정 시간은 44.5도에서 1.9×107 CFU/mL 일 때 140분, 42 CFU/mL 일 때 560분 이으며 사용된 기질에 상관 없이 거의 동일함을 보였다. 효소 GUS를 이용한 실험에서는 효소 유도체인 with methyl β-D-glucuronide sodium salt (MetGlu)를 사용하여 측정시간을 더 줄일 수 있었다. 대장균 농도와 측정시간의 관계 정립 후, 다른 실험실 샘플들은 그 관계식을 통해 대장균의 농도가 예측될 수 있었으나, 자연상태의 대장균 샘플은 긴 유도기 때문에 효소 유도를 하더라도 250분 정도의 측정 시간 지연이 있었다.
자연 샘플의 지나치게 긴 유도기는 대장균이 휴면기에 (dormancy) 접어 들었기 때문이라고 여겨졌고, 그렇기에 이번 연구의 후반부는 이 미생물 휴면기 (MFC 반응의 더딘 정도)를 줄이기 위한 연구와 한번 사용된 센서의 재사용을 위한 간편한 현장 살균 법을 찾는데 중점을 두었다. 이 두 가지는 센서의 정확도와 측정 속도를 높여 현장 적용성을 높이는데 꼭 필요한 요소이기에 중요시 여겨졌다. 연구를 위해, 휴면기의 대장균에게 여러 가지 물리적 혹은 화학적인 자극이 가해 졌으며, 동시에 전기화학적 살균이 행해졌다. 휴면기 대장균은 자연상태의 미생물을 모방하기 위하여 인공적인 굶김(영양분 미 공급)을 통해 만들어 졌으며, 230 분이나 되는 유도기의 연장이 확인되었고, 현미경을 통해 형태학적인 변형도 확인되었다. 이렇게 연장된 유도기를 다시 단축시키기 위하여 교반, 영양분과 신진대사의 중간단계 산물 공급, 효소 유도 등이 시도되었다. 그 중에 신진대사 물질인 pyruvate 의 공급이 미생물 유도기를 130분까지나 줄일 수 있으며, 대장균의 배가시간(doubling time) 도 4분을 줄이며 성장을 촉진할 수 있다는 것이 발견되었다. 현장 살균을 위해서는 직류전압을 센서의 두 전극을 통해 가해주는 방법이 사용되었는데, 0.05 M의 황산나트륨 수용액을 전해질로 사용하였을 때, 8 V의 직류 전압을 가해주면 1시간 미만에 완전한 살균이 이루어짐을 확인하였다. 이러한 발견들은 미생물 연료전지가 미생물 검출에도 이용될 수 있다는 것을 보여주며, 연료전지의 새로운 활용분야의 문을 넓힐 것이다.
