To study adjuvant effect of bacterial outer membrane vesicles (OMVs) with penta-acylated lipopolysaccharide (LPS), a ΔmsbB/ΔpagP mutant was generated from E. coli K12 W3110 wild-type strain. The mutant secretes OMVs with penta-acylated LPS (mOMV) while the wild-type bacteria secrete OMVs with hexa-acylated LPS (wOMV). there was a similarity between mOMV and wOMV on the basis of LPS. However mOMV was less active than wOMV in endotoxin assay using Limulus amoebocyte lysate (LAL). In addition, mOMV did not contain several proteins which were present in wOMV. In vivo toxicity assay, mice administered with mOMV showed higher survival rate than those administered with wOMV. These data showed that toxicity of mOMV was attenuated by modified acylation of LPS. Next, adjuvant effect of mOMV on T cell priming was determined. In immunization of C57BL/6 (wild-type) mice, mOMV enhanced immunogen-specific IFN-g production of splenocytes. In addition, mOMV with KLH protein enhanced immunogen-specific T cell clonal expansion. The proliferating T cells, especially CD8+ cells, produced TNF-a, suggesting mOMV-induced T cell cross-priming. The adjuvant effect was dependent on TLR4 as evidenced by markedly attenuated IFN-g production of splenocytes in TLR4 knock-out (K/O) mice. The effect of mOMV on BMDC was also studied. Interestingly, mOMV produced less amount of pro-inflammatory cytokines/chemokine including TNF-a, IL-6, and RANTES than wOMV, whereas it upregulated costimulatory molecules and antigen-presenting molecule such as CD86, CD80 and MHC-II as wOMV did. In conclusion, penta-acylated mOMV showed adjuvant effect on T cell priming in spite of less endotoxin toxicity.
지금까지 성공적으로 개발된 백신들은 병원체에 대한 항체반응을 유도하는 역할을 주로 수행한다. 이에 비하여, 아직까지 백신이 개발되어 있지 않은 C형 간염, 후천적 면역 결핍 증후군, 결핵과 같은 만성질환이나 암과 같은 신생물에 대한 백신에는 항체보다 T세포 면역이 필수적이다. 하지만, 단순히 병원체를 약독화 시킨 백신이나, 재조합된 단백질 또는 펩타이드 백신을 단독 투여함에 의해서는 T세포 반응을 효과적으로 유도할 수 없다. 따라서 강력하게 T세포 반응을 자극하는 면역증강제 개발이 필요하다. 강력한 백신 면역증강제 후보들은 주로 TLR (Toll-like receptor) agonist이다. 그 중 LPS (lipopolysaccharide)와 같은 TLR4 agonist가 유력한 후보인데, LPS의 강력한 독성 때문에 패혈증과 같은 심각한 부작용을 야기할 수 있다. LPS의 독성을 줄여 면역증강제로 사용하고자 하는 노력은 계속 있어 왔고, MPL (monohosphoryl lipid A)과 같은 약독화된 lipid A로 구성된 LPS가 개발된 바 있다. 그리고, Neisseria meningitidis의 백신으로 이용되는 세포외막소포 (OMV, outer membrane vesicle)는 LPS의 다른 형태로 안전하게 사용되고 있다. 하지만 그램음성균이 생명활동의 일환으로 분비하는 OMV는 LPS를 다량 함유하고 있기 때문에 이 역시 인체에 직접적으로 사용할 수 없는 한계가 있다. 그렇기 때문에 Nesseria meningitidis에서 생산되는 OMV를 백신으로 이용하기 위해서는 계면활성제 (detergent)로 처리하여 LPS의 함량을 최소의 수준으로 줄이는 방식이 이용되고 있다. 이렇게 OMV를 화학적으로 처리를 하게 되면, LPS의 함량이 줄어듦과 동시에 OMV에 포함되는 phopholipid, lipoprotein과 같은 다른 면역활성제 (immune potentiator)도 같이 제거되는 단점이 있어, 우리가 원하는 강력한 면역증강제가 되지 못할 수 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 lipid A의 생합성 과정에 관여하는 htrB, msbB, pagP와 같은 유전자를 제거시키는 방법이 개발되었다. 이러한 유전자의 제거로 독성이 강한 정상적인 hexa-acylated LPS 대신에 약독화된 penta-acylated LPS를 갖는 OMV를 얻을 수 있다.
본 연구에서는 비병원성 대장균인 E. coli K12 W3110으로부터 msbB유전자와 pagP유전자를 돌연변이 기법을 이용하여 불활성화하여, 돌연변이 대장균을 만들었다. 이 대장균에 의하여 생산되는 OMV (mOMV)는 약독화된 penta-acylated LPS를 갖게 된다. 먼저 이렇게 제조한 mOMV를 wild-type bacteria에서 유래한 wOMV와 비교 분석하였다. 전기영동을 통한 LPS 분석을 통해, mOMV와 wOMV는 비슷한 양의 LPS를 가지고 있음을 알 수 있었다. 이와는 별도로 OMV의 세포 외막 (OM, outer membrane)만을 추출하여 SDS-PAGE 후 Coomassie briliant blue (CBB) staining을 해서 OMV를 구성하는 불특정 단백질들을 본 결과, mOMV에서 최소 두 가지의 단백질이 소실된 것을 알 수 있었다. 이는 면역활성 작용을 갖을 수 있는 OM의 구성 단백질의 일부가 msbB 또는 pagP의 돌연변이에 의해 소실된 것으로 추정되는 결과이다. 한편 Limulus amoebocyte lysate (LAL) 검사법에서 mOMV의 내독소 활성은 wOMV에 비하여 10배 가량 낮게 측정되었다. 이는 wOMV와 비슷한 함량의 LPS를 갖는 mOMV의 내독소 활성이 훨씬 낮음을 나타낸다. 게다가, C57BL/6 쥐를 이용한 in vivo 독성 검사에서 mOMV를 주사한 쥐의 생존능이 wOMV를 주사한 쥐에 비하여 월등히 높음을 알게 되었고, mOMV가 약독화되었음를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 mOMV의 독성이 LPS의 생합성 과정에서 약독화되었음을 확정적으로 보여준다.
우리는 이렇게 얻은 mOMV가 T세포 감작을 유도하는 면역증강제로서 기능할 수 있는 지 알아 보았다. C57BL/6 wild-type 쥐에 KLH (Keyhole limpet hemocyanin) 단백질 또는 MHC-I에 제시되는 SIIINFEKL 에피토프 펩타이드 면역원을 주사하였고, 이때 mOMV의 면역증강효과를 면역원에 특이적인 IFN-g ELISpot 검사를 통해 확인하였다. 게다가 mOMV가 KLH 단백질에 특이적인 T세포 증식을 유도함도 CFSE (Carboxyfluorescein succimidyl ester) 증식능 검사를 통하여 확인할 수 있었다. 또한 ICS (intracellular cytokine staining) 검사에서 mOMV에 의해 유도된 항원 특이 CD8+ T 세포가 TNF-a를 분비함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 mOMV가 항원 교차 감작 (cross-priming)을 유도할 수 있음을 보여 주는 중요한 소견으로 mOMV가 T세포 백신을 위한 면역증강제의 좋은 후보라는 것을 알려준다. 한편, TLR4 knock-out (K/O) 쥐에서, 면역증강제로 사용된 mOMV는 비장세포의 IFN-g 분비능을 유도하지 못하였다. 이러한 결과는 mOMV의 면역증강 효과가 TLR4 신호전달 체계를 통하여 나타남을 보여준다.
다음으로 mOMV가 수지상세포에 미치는 영향을 알기 위하여 BMDC를 만들어 실험을 진행하였다. wOMV에 비하여, mOMV에 의하여 자극을 받은 BMDC는 TNF-a, IL-6와 같은 염증성 싸이토카인과 RANTES와 같은 케모카인의 분비를 적게함에도 불구하고, 면역증강 효과를 유도하는 CD86, CD80과 같은 co-stimulatory molecules와 MHC-II와 같은 항원 제시 물질은 wOMV와 비슷한 정도로 유도한다는 것을 알게 되었다.
결론적으로, wOMV에 비하여, mOMV는 독성은 약하고, 수지상 세포로 부터 염증성 싸이토카인을 분비시키는 능력은 더 작다. 하지만 mOMV는 co-stimulatory molecules와 항원 제시 물질을 유도함으로서 단백질과 펩타이드 백신 면역에서 T세포 감작에 면역증강효과를 나타낸다. 그러므로 mOMV는 HCV, HIV, TB 그리고 암에 대한 T세포 백신 개발에서 면역증강제로 이용할 수 있다.
