Ginseng, a celebrated traditional herbal product, had been used in empirical for thousands of years in Asian countries to cure disease and stay healthy. The major bioactive constituents found in ginseng were common regarded as ginsenoside, and besides that polysaccharide, polypeptide, volatile oil, amino acid, vitamin, etc also existed. Till now, almost over 50 kinds of naturally occurring ginsenoside have been isolated and characterized. In addition to the increased passion on miraculous fame of ginseng, recent decades, pharmaceutical of ginsenosides were lucubrated meticulously, and a couple of metabolize mechanisms and pharmacological functions were discovered and made improvement. In general, the whole ginsenosides have immunomodulatory, anti-tumor, anti-carcinogenic, anti-inflammatory, anti-allergic, anti-atherosclerotic, anti-stress, anti-diabetic, anti-proliferation, anti-genotoxic and anti-hypertensive and so as neurotransmission modulation etc, effects. Some ginsenoside structure related chemical compounds such as gypenosides also possess diverse pharmacological functions. Due to the vast beneficial value of ginsenosides, diverse research related ginsenosides were carried out such as isolation, purification and classification of ginsenosides; chemical, micrological and genetical-enzymatic method of bioconvsion of ginsenosides; bio-process industrialization large scale production of ginsenosides, etc.
In this study, we conducted screening and isolation the novel species bacteria with strong capability of transforming ginsenoside from ginseng soil, food water treatment bioreactor, plant soil and tidal flat. Couples of these species with the capability of transforming the major ginsenoside into pharmacological minor ginsenosides had been screened out by HPLC and TCL analysis. Besides, the nuclear magnetic resonance method was used to identify the isolated product. By means of multiple methods on biological evolution and systematical identification with 16s rRNA gene sequence and analysis of phylogenetic tree, there were 7 novel species which were confirmed to be the object of this study: Spingomonas sp. pi, Solirubrobacter ginsenosidimutans 2288T，Ramlibacter ginsenosidimutans 2277T, Phycicoccus ginsenosidimutans 2222T，Rhodanobacter panaciterrae 2249T, Paenibacter sediminis GTH-3T and Spingomonas sp. 2F2.
According to their different ginsenoside bioconversion metabolism pathway by TLC and HPLC confirming, one strain namely, Spingomonas sp. 2F2 which could convert ginsenoside Rb1 to gypenoside XVII and ginsenoside F2; ginsenoside Rb2 to ginsenoside C-O; ginsenoside Rc to ginsenoside CMC1; ginsenoside Rd to ginsenoside F2 was selectively constructed of fosmid cloned library. From the library, on the X-glc agar plates nearly 40 blue colonies were random picked up, and one fosmid clone was chosen to do full sequencing. The sequence with 36kb length was conducted to do similarity BLAST, eventually, one ORF was identified that encoded a putative β-glucosidase in glycoside hydrolase superfamily 1. Subsequently, sub-cloning was conducted using EcoRI and HindIII primers and the amplified fragment was inserted into pET-21-TEV-MBP modified vector, producing MBP fusion protein and expressing in E. coli BL21 (DE3). Ginsenoside transformation by BglSp was also confirmed by TLC. The pathway indicated that this pure glycosidase could convert ginsenoside Rb1 selectively to gypenoside XVII and ginsenoside F2.
In order to quantitative and qualitative analysis of this recombinant glycosidase so as the pure enzyme, isolation and purification of BglSp was carried out by FPLC using two steps purification by Amylose and DEAE cellulose Column.
The purified BglSp showed the apparent Km and Vmax values of 2.9 ± 0.3 mM and 515.4 ± 38.3 μmol??min-1??mg of protein-1 against p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside. The enzyme could hydrolyze the glucose moieties from the C-3 position and the outer glucose from the C-20 site of ginsenoside Rb1 with the optimal reaction condition pH 5.0 and 37°C. The cleavages occurred only in the outer glucose of C-3 for ginsenoside Rb2, Rc, Rd. to produce ginsneoside C-O, C-Mc1 and F2.
인삼은 유명한 전통 한약 재료로 아시아뿐만 아니라 여러 나라에서 건강유지와 질병의 치료를 위해 수천 년 동안 널리 사용 되고 있다. 인삼에서 주요한 생리 활성은 진세노사이드 물질에서 기인하며, 이외에도 polysaccharide, polypeptide, amino acid, vitamin 등의 물질도 포함 하고 있다. 최근 수십 년 동안 인삼과 단일 컴파운드 진세노사이드의 대사 시스템과 약리 기능에 대한 연구가 활발하게 진행 되었으며, 인체에 다양하고 높은 약리효과를 나타내는 마이너 진세노사이드에 대한 관심이 높아 지고 있다.
진세노사이드는 anti-tumor, anti-carcinogenic, anti-inflammatory등의 효과가 있으며, 결합한 당의 위치와 개수에 따라서 그 효과가 다르게 나타낸다. 그 중 지페노사이드ⅩⅦ 역시 다양한 약리효과를 가지고 있음이 밝혀 졌으나 아직 단일 컴파운드로 생산하지 못하고 있는 실정이다. 이러한 진세노사이드의 높은 가치는 단일 컴파운드의 생산 및 마이너 진세노사이드로의 전환하는 방법의 개발에 대한 관심을 높였으며, 화학, 미생물, 효소 유전공학 등의 여러 방법을 이용하여 대규모 생산의 생물 공업화 연구가 진행 되고 있다.
본 논문에서는 인삼 토양, 음식물 처리생물반응 장치, 식물 토양 그리고 갯벌 로부터 얻은 진세노사이드 전환 능력이 우수한 세 균주의 분리와 동정, 특성분석을 수행하였다. 진세노사이드 전환 능력은 HPLC와 TLC 분석을 통하여 마이너 진세노사이드로부터 약리의 미량 진세노사이드로의 전환 활성을 판별하였다. 16s rRNA 유전자의 생물학 진화, 계통학적 발견에 대한 다양한 방법과 계통수의 분석을 통하여 7개 (Spingomonas sp. pi, Solirubrobacter ginsenosidimutans 2288T，Ramlibacter ginsenosidimutans 2277T, Phycicoccus ginsenosidimutans 2222T，Rhodanobacter panaciterrae 2249T, Paenibacter sediminis GTH-3T and Spingomonas sp. 2F2)의 새로운 종을 분리하고 동정하였다. 그 중 가장 뛰어난 활성을 지닌 Spingomonas sp. 2F2를 선택 하고 fosmid clone library 를 구축하였다. 이Library 로부터, X-glc 가 포함된 배지의 색소기질법을 이용하여 40kb 삽인 된 fosmid clones을 스크리닝 하였고 그 중 진세노사이드 Rb1으로부터 지페노사이드ⅩⅦ로 전환하는 clone을 선택하여 시퀀싱을 통해 염기서열 정보를 확보하였다. BLAST search를 통하여 glycoside hydrolase superfamily 1 에 속하는 하니의 β-glucosidase ORF를 확인하였고 pET-21-TEV-MBP modified vector 와 E. coli BL21 (DE3) 를 이용하여sub-cloning을 하여 Amylose 과 DEAE cellulose Column을 이용하여FPLC로 효소를 정제하였고 특성을 분석하였으며, BglSp 로 명명하였다. 정제된 BglSp는 ginsenoside Rb1를 gypenoside XVII 과 ginsenoside F2 로 선택적으로 전환할 수 있음을 TLC와 HPLC를 통해 확인하였고, pH 5.0과 37°C 에서 최적반응을 보였다.
Spingomonas sp. 2F2는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 를 마이너 진세노사이드gypenoside XVII, C-O, C-Mc1, F2 로 각각 전환 능력을 보였다.
