Aberrant glycosylation has been observed in many types of cancer, but the mechanism of glycosylation change is still poorly understood. N-glycosylation status of purified β -haptoglobin (Hp) from sera of 17 colon cancer patients, and 14 normal volunteer subjects, was compared by blotting with various lectins and antibodies. Blotting index of serum β-Hp with Aleuria aurantia lectin (AAL) was clearly higher for cancer patients than for normal subjects. No such distinction was observed for blotting with three other lectins and two monoclonal antibodies. In order to assess the specificity of AAL binding to cancer as opposed to chronic inflammatory processes in colonic tissues, we studied β-Hp separated from sera of 5 patients with Crohn`s disease, and 4 patients with ulcerative colitis. AAL blotting index for all the Crohn`s disease cases, and 3 of the 4 ulcerative colitis cases, was lower than that for cancer cases, and similar to that for normal subjects. The higher AAL binding of β Hp in cancer patients was apparently due to presence of α L-fucosyl residue, since it was eliminated by treatment with bovine kidney α fucosidase. N linked glycans of serum Hp from cancer patients and from normal subjects were released by N glycanase, fluorescence-labeled, and subjected to normal-phase high-performance liquid chromatography (NP-HPLC). Glycan structures were determined based on Glucose Unit (GU) values and changes resulting from sequential treatment with various exoglycosidases. The glycans identified were sialylated or non-sialylated, bi-antennary or tri-antennary structures, with or without terminal fucosylation.
The glycosyl epitope dimeric Lea (Lea-on-Lea), defined by mouse monoclonal antibody NCC-ST-421, was identified previously as a tumor-associated antigen, expressed highly in various human cancer tissues and cell lines derived therefrom, but minimally in various normal tissues. Expression of dimeric Lea was clearly higher in β-Hp from sera of patients with colorectal cancer, compared to normal subjects or patients with chronic inflammatory processes. We therefore performed biochemical characterization of glycosyl epitope status in β-Hp. We concluded that dimeric Lea epitope is carried by O-linked but not by N-linked structure, since: (i) The strong reactivity of Colo205 cell supernatant with ST421 was reduced by pre-incubation of cells with benzyl-α-GalNAc. (ii) Treatment of β-Hp with α-L-fucosidase reduced its reactivity with ST421, but did not affect its reactivity with anti-Hp antibody. Treatment of purified β-Hp with PNGase F, which releases N-linked glycans, had no effect on reactivity with ST421, but changed the molecular mass from 40 to 30 kDa.
In order to clarify relationships between glycosylation status and colon cancer progression, we studied serum β-Hp samples from 46 cancer patients, 14 inflammatory bowel disease (IBD) patients, and 38 normal subjects. AAL reactivity was much higher for β-Hp from cancer patients than from the other two groups. These results were confirmed by lectin blotting and microarray assay using other lectins directed to fucosyl residues. Reactivity with fucosylated glycans was eliminated by treatment with α1-3/4 fucosidase but not α1-6 fucosidase, indicating that enhanced lectin reactivity with the fucose moiety of colon cancer β-Hp is due to presence of Fucα1-3/4GlcNAc. Site-specific glycan occupancy was determined by sequential LC/MS analysis. Mass spectrometric analysis showed that β-Hp fucosylation was higher in cancer patients than in the other groups, and that glycans attached to Asn 241 of β-Hp were oligosaccharides with fucosylated side chains. Levels of such glycans were correlated with stage of colon cancer progression, and with activity of specific fucosyltransferases (FUTs). Analysis of high-throughput screening datasets, using microarray assay and "ChIP-seq" method, showed that FUT-3, -4, and -7 were specifically and highly expressed during colon cancer progression. We identified 17 potential transcription factors that may regulate expression of the FUT genes.
변화된 당사슬 구조가 많은 암종에서 발견되고 있지만 정확한 기작은 아직 밝혀져 있지 않다. 17 명의 대장암 환자와 14 명의 정상인의 혈액에서 정제한 β-haptoglobin (Hp)의 N-linked 당사슬 구조를 렉틴과 항체를 이용하여 살펴 보았다. Aleuria aurantia 렉틴 (AAL) 블랏팅의 결과, 대장암 환자에서 정제한 β-Hp에서 보이는 신호가 정상인의 혈액으로부터 얻어진 β-Hp보다 현저히 높게 나타났다. 다른 세 종류의 렉틴 블랏팅 실험들이나 항체를 이용한 ELISA 실험에서는 정상인과 대장암 환자 사이의 차이를 보이지 않았다. 암종에서 보이는 AAL 렉틴 반응성을 양성종양의 그것과 비교하기 위하여, 5 명의 크론씨병 환자와 4 명의 대장궤양 환자의 혈액으로부터 β-Hp을 정제한 후 AAL 반응성을 확인하였다. 그 결과 대장궤양 한 경우를 제외하고 대장암 환자 β-Hp에서 보이는 반응성은 대장궤양 환자의 그것에 비해 현저히 높았다. 소의 췌장에서 유래한 α-L-fucosidase를 이용한 실험 결과 대장암 환자 β-Hp에서 증가한 AAL 반응성은 α-L-fucose 때문인 것으로 밝혀졌다. 대장암 환자와 정상인의 β-Hp의 N-linked 당사슬 구조는 N-glycanse 효소를 이용하여 자르고 형광물질을 표지 한 다음 정상크로마토그래피를 이용하여 당사슬 구조를 분리하였다. 분리된 당사슬 구조는 Glucose Unit (GU) 기준과 다양한 종류의 말단 당사슬 구조 자름효소를 이용하여 예측할 수 있었다. 동정된 당사슬 구조는 시알산이나 과당을 포함하는 bi-antennary 또는 tri-antennary 구조 이거나 포함하지 않는 당사슬 구조였다.
쥐유래 단일항체인 NCC-ST-421으로 인지되는 dimeric Lea 구조는 종양과 연관된 항원으로써 다양한 종류의 인간 암 조직과 세포주에서 높게 발현되지만 정상 조직에서는 그렇지 않다. 대장암 환자의 혈액에서 정제한 β-Hp에서 dimeric Lea 구조가 양성종양 환자나 정상인보다 현저히 증가한다는 사실을 발견하고, 생화학적 접근을 이용하여 dimeric Lea 구조가 O-linked 당사슬 구조와 연관이 있음을 보였다: (i) benzyl- α-GalNAc 처리 후 Colo205 대장암 세포주 배양액에 대한 강한 ST421 반응성이 현저히 감소하였다. (ii) α-L-fucosidase 처리된 β-Hp의 ST421 반응성은 감소되었지만, Hp항체의 반응성에는 영향이 없었다. PNGase F 처리된 β-Hp은 ST421 항체 반응성에서 차이를 보이지 않았지만, 분자량이 40 kDa에서 30 kDa으로 감소되었다.
당사슬 구조변화와 대장암 진행과정 사이의 관계를 밝히기 위하여, 46 명의 대장암환자, 14 명의 양성종양환자, 그리고 38 명 정상인의 혈액을 확보하였다. 증가된 샘플 수에서도 대장암 β-Hp에 대한 AAL 반응성은 앞서 보였던 것과 같이 다른 연구 그룹 들에 비해 현저히 높게 나타났다. 이러한 결과는 과당을 인식하는 다른 종류의 렉틴 들을 이용한 렉틴 블랏팅 실험과 마이크로 어레이 방법에서도 같게 나타났다. 과당구조에 대한 반응성은 α1-3/4 fucosidase 처리시 현저히 감소한 반면, α1-6 fucosidase 처리에서는 차이를 보이지 않았다. 이를 통해, 대장암 환자에서 정제한 β-Hp에서 증가하는 과당은 α1-3/4 fucosylation이라는 것을 알 수 있었다. 질량분석기를 이용한 위치특이적 당사슬 구조을 분석 결과에서도 대장암 환자 β-Hp 내 과당이 정상인이나 양성종양환자에 비해 높게 나타났으며, 증가된 과당은 Asn 241에 연결되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 당사슬 구조는 대장암의 진행 단계와 연관이 있었으며, 특정 종류의 fucosyltransferases (FUTs) 효소와 관련되어 있었다. 마이크로 어레이 방법과 “ChIp-seq” 방법을 이용한 고속대량스크리닝 데이터 분석을 통하여, 대장암의 진행단계에 있어 FUT-3, -4, -7 효소가 특이적으로 그리고 현저히 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 우리는 FUT 유전자의 발현을 조절할 수 있는 17 개의 잠재적인 전사인자를 발견하였다.
