Now that many genomes have been sequenced and the products of newly identified genes have been annotated, the next goal is to construct a microbial cell factory through genome engineering. We developed techniques for precise genomic surgery and applied them to deleting the largest non-essential genes, identified by comparative genomics as recent horizontal acquisitions to the genome. They are loaded with cryptic prophages, transposons, damaged genes, and genes of unknown function. Here, we constructed and characterized a novel minimized-genome strain of Escherichia coli MS56 that lacks 23% of the non-essential genomic regions. The minimized-genome strain MS56 grew as well as a wild type and continued to grow even in the stationary phase of MG1655. The final cell density of MS56 was 1.5 times higher than that of MG1655 in M9 minimal medium. And MS56 could increase the production of pyruvate and acetate. In addition, genome-wide transcriptional profile analysis revealed that the elimination of unnecessary genes have resulted in nutrient and energy saving and an improved substrate yield coefficient, causing more efficient cellular metabolism without physiological compromise.
Furthermore, redistribution of the overflowed metabolic flux of MS56 increased the growth rate and biomass accumulation clearly. The strain showed a 3.7 and 1.2??fold decreased in pyruvate and acetate production, compared to MS56. And the optimization of medium in minimized-genome MS56 strains culture further increased the growth, biomass and productivity of recombinant proteins. In addition, expression and secretion of recombinant proteins in MS56 strain was increased by >2-fold compared to that of MG1655. Production of therapeutic proteins such as bone morphogenetic protein-4, basic fibroblast growth factor in MS56 increased the production yield and solubility of protein. These results and the general applicability of this platform clearly indicate that minimized-genome strain MS56 are microbial cell factory for a robust and suitable host and can facilitate production of recombinant proteins of interest.
방대한 양의 유전체 정보가 축적된 포스트 게놈 시대의 도래 이후, 이를 토대로 재설계된, 효율적이고 강력한 특성의 새로운 microbial cell factory의 제조의 개발과 중요성이 전세계적인 관심사로 대두되면서 이를 위한 연구가 활발히 진행 중이다. 유전체의 재설계에 의한 새로운 생물 산업용 균주 개발은 방대한 미생물 유전체 정보를 비교 분석하여 중요한 미생물의 유전적 기능 및 특성을 극대화하고 이를 실제 인간 생활에 효율적으로 이용하는데 필수적인 연구 분야이다. 이는 지금까지 인류가 수행해 온 종의 발견과 이들의 점진적 개량과는 대비되는 것으로 지금까지의 종의 개량이 선택적 특성을 갖는 종의 개체를 선별한 것이라면, 유전체 재설계는 생물 유전체 정보를 바탕으로 체계적이며 논리적인 접근을 통하여 단시간에 좀더 정확하고 예측 가능한 종을 개발하는 것이다. 이는 수많은 미생물의 생물학적 특성을 규명하고도 낮은 효율성과 경제성 때문에 실제 인간 생활에 적용되지 못한 것들을 개량하여 실제 인간생활에 직ㆍ간접적으로 활용할 수 있도록 하기 위함이다. 이런 microbial cell factory는 가장 많은 유전체의 기능 및 정보가 밝혀졌고 기초학문 뿐 만 아니라 응용분야에서도 가장 널리 사용되고 있으며 병원성을 나타내지 않고 수많은 유전체와 유전자 공학이 개발되어 유전체 재설계 뿐 만 아니라 실험적 검증 및 분석이 가장 용이한 대장균을 토대로 구축되어져 가고 있다.
본 연구에서는 이러한 microbial cell factory를 개발하기 위해서, 현재 생명공학 산업에서 가장 널리 이용되고 있는 산업 균주인 대장균 유전체로부터 성장과 유용물질 생산에 불필요한 유전자를 제거하여 불필요한 유전자23.1%가 제거된 최소유전체 균주, MS56를 제작하였다. 이와 같은 최소유전체 균주 MS56는 빠른 균주 성장 도모와 대사효율을 효과적으로 증진시켰다. 이러한 특징으로 인해 외부 단백질 생산에 있어서 cytoplasm내에서 발현되는GFP는 생산량이 3.6배가 증가되었고, 배지 내로 분비되는 lipase 생산량 또한 2.2배 증가시킬 수 있었다. 또한 배지 최적화와 대사흐름의 최적화를 통해 균주의 성장과 치료용 단백질 생산 증가를 도모하였다. 그 결과, 치료용 단백질인 bFGF는 단백질 생산성이 약 3배가 증가 되었으며, BMP-4는 soluble 형태의 단백질 생산이 증가 되었다.
이와 같은 결과로부터 본 연구에서 개발한 최소유전체 균주는 실제적으로 생물 산업 전반에서 유용물질은 생산뿐만 아니라 유전체 기능 연구 및 규명에도 효과적으로 이용될 수 있다.
