Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most frequently used mammalian cell lines for the production of therapeutic proteins. Growing demand for therapeutic proteins promotes the development of technologies for high quality and productivity in CHO expression systems. To increase the protein productivity, there have been intensive efforts such as developing culture medium, optimizing culture condition, developing culture process, and engineering host cells. Most of these strategies appear to be evolving towards enhancing the cell growth and improving the inefficient metabolism such as an excessive lactate formation from pyruvate. In this study, the cell engineering approach was adopted to improve two culture performances, cell growth and metabolism. Apoptosis, a physical and developmental death triggered by a variety of stresses, has been successfully prevented by overexpressing the anti-apoptotic proteins in Bcl-2 family such as Bcl-xL and Bcl-2. To examine the effect of Bcl-xL overexpression on lactate metabolism as distinct from on the survival, two recombinant CHO (rCHO) cell lines producing chimeric antibodies at a different expression level were cultivated in batch mode. To regulate the Bcl-xL expression, the Tet-off system was introduced in two cell lines, thereby the possibility of clonal variability could be excluded. The specific lactate production rate (qLac) of two cell lines in the presence of doxycycline were 12.21 ± 0.13 and 11.10 ± 0.54 μmol/106cells/day, respectively. In the absence of doxycycline, Bcl-xL overexpression did not reduce qLac, regardless of the cell lines, though it enhanced the viability during the batch cultures. Taken together, Bcl-xL overexpression showed no significant effect on lactate metabolism of rCHO cells.
To reduce the lactate formation from pyruvate, lactate dehydrogenase A (LDH-A), an enzyme catalyzing the conversion of glucose-derived pyruvate to lactate, was downregulated by an expression vector of small interfering RNAs (siRNA) in dihydrofolate reductase-deficient (dhfr-) CHO cells. Three clones expressing low levels of LDH-A (dhfr- CHO-LDHAsi; L17, L23, L34) were screened by Western blot analysis. During the batch cultures, the qLac or the apparent yield of lactate from glucose (YLac/Glc) was reduced in three clones. Moreover, the maximum viable cell concentration of dhfr CHO-LDHAsi cells was 1.2-1.5-fold higher than that of the control cells. Therefore, the reduction of LDH-A did not impair cell proliferation, and in fact slightly enhanced it. When the dhfr- CHO-LDHAsi cell line was used as a host cell line for the development of rCHO cell producing an Fc-fusion protein (Valpha), the lactate production of the rCHO cells was decreased without any detrimental effect of genetic engineering on specific protein productivity. The YLac/Glc of LDH-A downregulated rCHO cells was decreased by 46-64% compared to the control cells. Taken together, the lactate formation in dhfr- CHO cells can be effectively reduced through the downregulation of LDH-A via siRNA, and the genetically manipulated expression of LDH-A in dhfr- CHO cells was stably maintained during rCHO cell development without detrimental effect on the Valpha production.
However, despite the reduced lactate production rate, cell cultures were eventually terminated in the late period of the culture, mainly due to apoptosis. Therefore, I developed an apoptosis-resistant, less lactate-producing dhfr- CHO cell line (CHO-Bcl2-LDHAsi) by overexpressing Bcl-2, one of the most well-known anti-apoptotic proteins, and by downregulating LDH-A in a dhfr- CHO cell line. When the dhfr- CHO-Bcl2-LDHAsi cell line was used as a host cell line for the development of rCHO cells producing Valpha, the culture longevity of the rCHO cells was extended without any detrimental effect of genetic engineering on specific protein productivity. Simultaneously, the qLac and YLac/Glc were reduced to 21-65% and 37-78% of the control cells, respectively. Taken together, these results show that the use of an apoptosis-resistant, less lactate-producing dhfr- CHO cell line as a host cell line saves the time and the effort of establishing an apoptosis-resistant, less lactate-producing rCHO cells for producing therapeutic proteins.
To elucidate the metabolic changes after the partial blocking of the lactate production from pyruvate by downregulating LDH-A, I investigated the activity and mRNA expression of key enzymes involved in glucose metabolism in normal and genetically engineered CHO cells. The hexokinase activity was unaltered in most of the LDH-A downregulated cells, and the reduction of the specific glucose consumption rate (qGlc) was caused by the reduced expression of glucose transporter 1. The reduced activity and expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase in the LDH-A downregulated cells suggested that the downregulation of LDH-A did not increase the glucose flux towards the pentose phosphate pathway. No activity of pyruvate dehydrogenase and pyruvate carboxylase could be detected before and after the LDH-A downregulation, suggesting there was no increase flux to the TCA cycle via these two enzymes. On the other hand, the activity of alanine aminotransferase (AlaAT) was increased by 15-41% compared to the control. Taken together, it could be considered that more pyruvate would take the alternative pathway via AlaAT rather than producing lactate. However, the enzyme activities were not always correlated with the mRNA level, indicating other factors could be involved in the activity and expression such as the post-translational modification or the multiple roles of the enzyme in the cellular process.
In conclusion, the rCHO cells established using dhfr- CHO-Bcl2-LDHAsi as a host cell line retained two improved properties and displayed increased specific protein producvitivy (qp) by gene amplification, demonstrating the potential of dhfr- CHO-Bcl2-LDHAsi as a superior host cell line. In addition, the downregulation of LDH-A shifted the metabolic pathways more towards pyruvate as a substrate via AlaAT.
CHO세포는 치료용 단백질 생산을 위해 널리 사용되는 세포로서 치료용 단백질에 대한 수요가 계속적으로 증가함에 따라 CHO 발현 시스템 하에서 양질의 단백질 생산을 위한 기술의 발달이 더욱 요구되고 있다. CHO세포의 단백질 생산성을 향상시키기 위해 배양 배지 개발, 배양 조건 최적화, 배양 공정 개발, 세포 공학 등의 다양한 노력이 시도되고 있다.
본 연구에서는 CHO 세포에 세포 공학 방법을 적용하여 세포 성장과 세포 대사를 향상 시켜 궁극적으로 단백질 생산을 향상 시켰다. 세포 배양 시 여러 가지 스트레스로 인해 유발되는 세포사멸(apoptosis)은 Bcl-xL 및 Bcl-2의 과발현을 통해 효과적으로 예방할 수 있다. Bcl-xL의 과발현이 세포 생존이 아닌 젖산의 대사에도 영향을 주는지 알아보기 위해 각각 다른 항체 생산성을 가진 두 개의 재조합 CHO 세포주를 회분식 배양으로 배양하였다. Tet-off system 을 도입하여 Bcl-xL의 발현을 조절함으로써 클론 다양성에 의한 결과를 배제할 수 있었다. Bcl-xL을 과발현 하지 않은 경우의 두 세포주의 젖산 비생성 속도는 각각 12.21 ± 0.13 및 11.10 ± 0.54 μmol/106cells/day였고, Bcl-xL을 과발현 한 경우 세포의 생존율은 증가하는 데 반해 두 세포주 모두 젖산 비생성 속도에는 변화가 없었다. 결과적으로 Bcl-xL의 발현이 재조합 CHO세포의 젖산 대사에는 영향을 주지 않음을 확인하였다.
CHO세포 배양 시 포도당으로부터 유도된 피루브산의 대부분이 A형 젖산 탈수소효소(LDH-A)에 의해 젖산으로 전환되는데, LDH-A에 의한 젖산의 생성을 억제하기 위해 DHFR이 결핍된 CHO세포에 LDH-A에 대한 짧은 헤어핀 RNA (siRNA)를 발현하는 벡터를 도입하였다. 면역 블롯(Western blot)분석을 통해 LDH-A의 발현이 낮은 세 개의 클론(L17, L23, L34)을 선별한 후 회분식 배양을 수행한 결과, 모든 클론에서 젖산 비생성 속도 또는 포도당 하나당 젖산의 생산량이 감소함을 확인 하였다. 또한 회분식 배양 중 LDH-A를 저발현 하는 세포의 최대 세포 농도가 대조군 세포에 비해 1.2-1.5배 중가하여, LDH-A의 발현 억제가 세포 성장을 저해 하지 않고 오히려 향상시키는 결과를 보였다. LDH-A를 저발현 하는 DHFR이 결핍된 CHO세포를 숙주 세포로 하여 Fc-융합 단백질인 Valpha를 생산하는 재조합 CHO세포를 제조한 결과, 대조군 세포를 사용한 경우에 비해 포도당 하나당 젖산의 생산량이 46-64% 감소했으며 단백질 생산성에도 해로운 영향이 없었다.
그러나 젖산 비생성 속도의 감소에도 불구하고, 배양 후반부에 일어나는 세포사멸에 의해 결국 세포 배양이 종료 되었다. 이에 LDH-A를 저발현 하는 DHFR이 결핍된 CHO세포에 항세포사멸 단백질로 잘 알려진 Bcl-2를 추가적으로 과발현 하게 함으로써 젖산을 적게 생성하면서 세포사멸에도 저항성을 가진 세포주를 확립하였다. 이렇게 확립된 CHO세포를 숙주 세포로 하여 Valpha를 생산하는 재조합 CHO 세포를 제조한 결과, 단백질 생산성에 해로운 영향 없이 세포의 생존 기간이 연장되는 동시에 젖산 비생성 속도 및 포도당 하나당 젖산의 생산량이 각각 대조군 세포의 21-65% 및 37-78% 수준으로 감소했다. 본 연구를 통해 제조된 Bcl-2 및 LDH-A의 발현을 조작한 DHFR이 결핍된 CHO세포를 숙주 세포로 사용하면 필요한 단백질 생산을 위한 유전자 조작 재조합 CHO세포를 제조하는 시간 및 노력을 절감할 수 있는 동시에 세포사멸과 젖산의 생성도 효과적으로 줄일 수 있다.
이와 같이 LDH-A의 발현을 억제함으로써 피루브산으로부터 젖산의 생성을 부분적으로 차단한 경우 세포 대사에 어떤 변화가 일어나는지 확인하기 위해 정상 세포와 유전자 조작된 세포에서 포도당 대사에 관여하는 주요 효소의 활성과 mRNA 발현을 조사하였다. LDH-A를 저발현 한 경우 hexokinase 의 활성에는 변화가 없었으며, 세포의 포도당 비소모 속도의 감소는 glucose transporter 1의 발현 감소에 의한 것임을 알 수 있었다. LDH-A를 저발현 하는 세포의 glucose-6-phosphate dehydrogenase 의 활성 및 mRNA 발현의 감소는 LDH-A의 저발현이 pentose phosphate pathway로의 포도당 유입을 증가시키지는 않음을 시사한다. 또한 LDH-A의 발현을 억제한 경우에도 여전히 pyruvate dehydrogenase 와 pyruvate carboxylase 의 활성이 탐지 되지 않은 것으로 보아 이들 두 효소에 의한 TCA cycle로의 피루브산의 유입이 증가하지 않은 것으로 보인다. 반면, alanine aminotransferase (AlaAT)의 활성은 대조군 세포에 비해 15-41% 증가했다. 따라서 LDH-A의 발현 감소로 인해 피루브산이 젖산을 생성하는 경로를 덜 취하는 대신 AlaAT에 의해 다른 경로로 대사됨을 확인하였다. 그러나 효소의 활성이 mRNA의 발현 정도와 항상 상관관계를 보이지는 않았는데, 번역 후 수정과정에서 효소의 활성이 조절되거나 또는 효소가 세포 내에서 물질 대사뿐 아니라 여러 가지 과정에 관여하기 때문인 것으로 추측된다.
결론적으로, 본 연구를 통해 DHFR이 결핍된 CHO 세포에 Bcl-2를 과발현 하고 LDH-A를 저발현 함으로써 두 가지 성능이 향상된 우수한 숙주 세포주를 제조하였으며, 이렇게 확립된 세포는 피루브산으로부터 젖산을 적게 생성하는 대신 AlaAT에 의해 피루브산을 기질로 하는 반응이 증가함을 확인하였다.
