Escherichia coli periplasm has a suitable environment for the production of proteins with essential disulfide bonds. The periplasm, however, has not been widely employed for the production of recombinant proteins because of its limited space and secretion capacity, degradation of recombinant proteins by proteases, and aggregation of proteins overexpressed in the periplasm. To overcome these problems, we have restructured E. coli periplasm by removing unnecessary genes encoding periplasmic proteins that interfere the expression of heterologous proteins in the periplasm.
Forty six out of 170 periplasmic genes (27% of total periplasmic genes) were deleted from the E. coli MG1655 genome by a rapid markerless deletion system. With the periplasm-restructured E. coli, expression of alkaline phosphatase and human leptin was examined. In the restructured periplasm, a twofold increase in the production of the alkaline phosphatase was obtained and 2.5 times more leptin was produced in a soluble form than that obtained with E. coli MG1655. Comparative proteomics of the periplasm-restructured strain (PRS46) and MG1655 confirmed the targeted deletions, and a total of 10 different periplasmic proteins were identified whose abundance changed significantly between the PRS46 and MG1655: some genes (aphA, glpQ) were overexpressed by more than 6-fold in the PRS46 and others (xylF, araF) were repressed 2-fold. Interestingly, several periplasmic proteins (Dcp, TolB, PstS, CysP, GltI, LptA) were newly induced. These identified periplasmic proteins were involved in nutrient transports, central intermediary metabolisms, and cell envelope formation. This periplasm-restructured E. coli will be beneficial for the production of a wide range of recombinant proteins through increasing the protein productivity and solubility.
매년 30%씩 증가하는 의약품 시장의 활기에 힘입어 다양한 경로를 통해 보다 양질의 재조합 단백질을 경제적으로 생산하려는 연구가 활발히 진행 중이다.
이에 본 연구에서는 미생물인 대장균에서 재조합 단백질을 보다 효율적으로 생산하기 위한 미생물 균주의 구축을 위해 유전체의 정보와 제거 기술을 이용하여 대장균의 periplasmic space를 재구성하는 연구를 수행하였다.
Periplasmic space는 대장균의 inner membrane과 outer membrane 사이에 존재하는 공간으로 cytoplasm에 비해 상당히 산화적인 환경으로 인해 disulfide bond 형성을 요구하는 재조합 단백질의 생산에 용이하다. 그러나 periplasm의 제한된 공간과 분비 시스템을 periplasm 구성 단백질과 생산하려는 재조합 단백질이 공유하기 때문에 분비 효율과 생산성, 단백질의 안정성에 문제가 생긴다. 이에 본 연구에서는 불필요한 periplasm 구성 요소를 제거하여 이러한 문제를 해결하고자 하였다.
다양한 유전체 정보를 활용하여 불필요한 periplasm 구성 유전자를 선별하고, 단시간에 흔적없이 원하는 유전자 구간만을 제거할 수 있는 markerless deletion 방법을 이용하여 선별한 periplasm 유전자들을 제거하여 periplasm 재구성 균주 PRS46을 구축하였다. 이렇게 구축한 PRS46 균주는 성장에 문제가 없었으며, periplasm 프로테옴으로 전체 periplasm 구성요소의 약 27%가 제거되었음을 확인하였다. 또한 alkaline phosphatase 단백질을 이용하여 구축한 균주의 periplasm에서의 단백질의 생산성이 2.5배 이상 증가되는 것을 확인하였으며 생산된 단백질의 안정성 또한 증가됨을 보일 수 있었다. 이러한 결과는 또 다른 재조합 단백질의 생산에도 적용되어 같은 결과를 나타내었다. 인체의 비만유도와 관련된 단백질인 human leptin을 구축한 균주 PRS46의 재구성 periplasm에서 생산하였을 때 동일 계통의 야생 균주보다 8배 높은 안정적 생산성을 보였다. 또한 단백질 생산에 사용되는 상업성 대장균주의 periplasm과 전체 생산량을 비슷하나 활성 단백질로의 생산이 2.5배 이상 높은 효율을 보였다.
이와 같은 결과로부터 본 연구에서 구축한, 불필요한 구성 유전자가 제거된 periplasm 재구성 대장균 균주는 재조합 단백질 뿐 아니라 의약용 단백질 및 항체의 효과적인 생산을 유도할 수 있는 획기적인 균주이며, 이를 위해 적용한 접근 방식 또한 방대한 양의 유전체 정보를 적극적으로 활용하여 미생물 균주를 개량할 수 있는 획기적인 방법이라는 결론을 내릴 수 있었다.
