Schiff bases with the azomethine (-C=NR) group are a condensation product of a primary amine and a carbonyl group in which $H_2O$ is eliminated. These groups are easily able to chelate many types of metal ions. Hence, a range of metal complexations have been assessed and a great number of metal Schiff base complexes have been reported. Some of them have shown for stereo- / enantio-selective catalytic activity or antibacterial or anticancer effects. They also show a range of characteristics in terms of their geometry, magnetic and optical properties. Thus, research on metal-Schiff base complexes has wide-ranging implications in the fields of organic, inorganic, and biochemistry, and pharmacology fields. Here, based on an aqueous blue fluorescent dimeric $Zn^{2+}$-Schiff base complex characterized in previous work by us, we focused on in situ $Zn^{2+}$-Schiff base complexation using $Zn^{2+}$, aromatic aldehydes as a fluo-rophore, and amino acids in physiological aqueous media, with the solutions assayed through fluorescence measurements. These studies can provide useful and basic information on the design and synthesis of efficient $Zn^{2+}$ sensors with a good yield as well as allow for a better understanding of the formation of reversible Schiff base formation through self-assembly and their interactions with metal ions in biological systems.
In Chapter 1, aqueous in situ $Zn^{2+}$-Schiff base formation was studied by fluorescence at the 50 μM level using salicylaldehyde and a homologous series of D/L-amino acids [$H_2NCH(COOH)(CH_2)_nNH_2$ (n = 1 - 4)]. MALDI-TOF MS spectrometry and UV-vis absorption, fluorescence and $^1H$ NMR spectroscopy were used in characterization. The three components ($Zn^{2+}$, salicylaldehyde and $H_2NCH(COOH)(CH_2)_nNH_2$) were each titrated separately at different molar concentration ratios (0-10 equiv) and reaction times (> ~28 h) at a pH of 7.4 and RT (25~30℃). All trials generally showed fluorescence ($λ_{em}$ = 450-460 nm; $λ_{excit}$ = 352 nm), with increases in [Zn-salicylaldimine] roughly proportional to the increase in the amount of titrant. However, when Sal was added (type III) at 3+ equiv, there were decreases for all AAs. Furthermore, the longer the residue of the lysine homologue used, the higher the value of F. I. observed from the three-component mixture for all types I-III. To determine the cause of the trend in F. I. due to the different residue length of the lysine homologue, related mono-α-amino acids ($H_2NCH(COOH)(CH_2)nCH3$, n = 1-3), and diamines ($H_2NCH_2(CH_2)nNH_2$, n = 1-4) were tested. Additionally, alanine, glycine, and β-alanine were used. The trials using glycine, alanine, and the series of mono-α-amino acids as an AA source showed a limited (steric) effect caused solely by the different residue length, irrespective of the existence of a distal amino group, on the straightforward $Zn^{2+}$-Schiff base complexation, the kind of interaction that simple glycine would engage in. It was also revealed that the trends in F. I. according to types I-III were not due to only the distal amino group, as noted by the similar trends as well in the case of mono-α-AA. Essentially, we expected that the different residue lengths of lysine homologues also involve differences in pKa values and AA group dissociation constants as well as the steric effect or structural ability / stability when forming $Zn^{2+}$-Schiff base complexes. These factors can lead to a different distribution of the species produced in the three-component mixtures at an equilibrium state thermodynamically. Through this prediction, and according to comprehensive analysis of the spectral data, the residue effect of lysine homologues leading to interesting trends in the F. I. values was attributed to the activity of a distal amino group in the residue for the $Zn^{2+}$-Schiff base complexation with fused 5- and 6-membered chelate ring cores. It was also noted that the advantage of high excess of AA or $Zn^{2+}$ for in situ blue fluorescent $Zn^{2+}$-Schiff base complexation depends on the affinity between AA and $Zn^{2+}$, whereas a high excess of salicylaldehyde always interrupts the formation, irrespective of AA.
In Chapter 2, several variations of salicylaldehyde were studied regarding the formation of in situ fluorescent $Zn^{2+}$-Schiff base complexes under a condition identical to protocol used in Chapter 1. [$X-C_6H_3(OH)(CHO)$] -X = -H, -F, -$NO_2$, -Me, -OH and O-anisalaldehdye [$C_6H_3(OMe)(CHO)$] and 2-hydroxy-1-naphthaldehyde [$C_{10}H_6(OH)(CHO)$] were tested. Here, we tried to discover a better fluorophore leading to higher fluorescence intensity and possibly longer excitation ($λ_{ex}$) and emission ($λ_{em,,max}$) wave-length values in the $Zn^{2+}$-Schiff base complexation that could be applied to a biosystem. However, when compared to a system based on salicylaldehyde (Sal), poor fluorescence intensities were generally observed in the fluorescence profiles, although some of them showed longer $λ_{ex}$,, and λem, max wavelength. Only 5-fluorosalicylaldehyde (5-FS) led to comparable fluorescence intensity ($λ_{em, max}$ = 460 nm, $λ_{ex}$ = 341 nm) in the formation of $Zn^{2+}$-Schiff base complexes. The aromatic aldehydes assayed in this work, apart from 5-FS, showed little potential for the creation of highly efficient “off-on” $Zn^{2+}$ probing systems, but the data obtained from this assay can be a useful resource for other related sensing systems.
In Chapter 3, the formation of $Zn^{2+}$-Schiff base complexes, induced by a four-component system based on the pinacol ester of 2-formylphenyl boronic acid (2-FPBPE) and $H_2O_2$, was tested in a similar manner to the methods used in Chapters 1 and 2. Although the F. I. values ($λ_{em,max}$= 452, $λ_{ex}$= 326 nm) de-rived from the four-component systems were far lower than the F. I. values ($λ_{em,max}$= 451-53, $λ_{ex}$= 326-7 nm) derived from the three-component systems using sal, lys, and $Zn^{2+}$, an increase in the F. I. value was observed with an increase in the amount of $H_2O_2$. This preliminary study showed that $H_2O_2$ can induce sal from 2?-FPBPE to lead to the $Zn^{2+}$-Schiff base complexation in a four-component condition, thus demonstrating the possibility of this system being developed into a sensor system for $H_2O_2$ or for both $H_2O_2$ and $Zn^{2+}$ in the future.
1 장에서는 생리적인 수소 이온 농도 (pH 7.4)하의 $Zn^{2+}$ 이온, 살리실알데하이드, D,L-라이신 유사체[$NH_2CH(COOH)(CH_2)_nNH_2$, n=1-4] 이 3 성분의 혼합물로부터 자연적으로 형성되는, 청색 형광을 내는 수용성 쉬프 염기-아연 (II) 화합물의 형성을 형광을 통하여 연구하였다. 쉬프 염기-아연 (II) 화합물의 형성과 그에 따른 그 혼합물의 성분 변화를 보기 위해 형광 분광법 뿐만이아니라 자외선-가시광선 흡광, 및 $^1H$ 핵자기공명 분광법과 MALDI-TOF 질량 분석법이 이용되었다. 그 3 성분 중의 각각 한 성분을 분석물로서 50 μM 의 나머지 두 성분들에 대하여 0 - 10 당량 범위에서 처리하는 types I-III의 유사-적정 방법이 pH 7.4 로 조절된10 mM 의HEPES버퍼 용액, 24 시간 반응 시간, 실내 온도 (25-30 °C) 조건 하에서 수행되었다. 그 types I-III 유사-적정법을 이용하여 만들어진 모든3 성분 혼합물의 시료는 352 nm를 흡수 파장으로 하는 형광 측정 시 450-60 nm 부근에서 최대 형광을 나타내었다. 그 혼합물에서 형성되는 살리실알디민-아연(II) 화합물의 증가는 분석물의 증가와 대체로 비례하였다. 그러나 살리실알데하이드가 분석물로서 3 당량 이상이 처리 된 type III의 시료에서는 어떤 라이신 유사체가 사용되었든지 상관 없이, 그 분석물의 농도가 높을 수록 더 약학 형광이 방출되었다. 또한 3 성분-혼합물 시료의 아미노산 성분이 더 긴 잔기를 가진 라이신 유사체일 경우 더 높은 형광 세기가 나타났다. 라이신 유사체의 잔기 길이에 따라 형광 세기에서 나타나는 경향성의 원인을 분석하기 위해 라이신 유사체와 연관 된 일련의 모노-아미노산 [$NH_2CH(COOH)(CH_2)_nCH_3$, n=1-3], 다이아민 [$NH_2CH_2(CH_2)_nCH_3$, n=1-4] 유사체 및 alanine, glycine, β-alanine 이 3 성분-혼합물 시료의 아미노산 성분으로서 이용되었다. 3 성분-혼합물 시료에서 라이신 유사체들을 아미노산 성분으로 이용 시 형광의 세기가 lys > orn >> dab > dap 순서로 나타나는 경향의 주원인은 짧은 잔기 말단의 -$NH_2$ 활성에 의한 것으로 결론지어졌다. 그룹 해리 상수에 의한 효과와 더불어 짧은 잔기 말단의 $NH_2$ 은 더 다양하고 안정한 아미노산-아연(II) 화합물 형성을 가능하게 하고 이는 열역학적인 평형 상태에서 쉬프 염기-아연(II) 화합물의 분포를 불리하게 유도할 수 있다. 따라서 dab 또는 dab 이용 시 상대적으로 더 약한 형광 세기가 나타나는 것으로 보인다. 또한 상당한 살리실알데하이드의 초과 조건은 아미노산 성분에 관계 없이 청색 형광을 내는 쉬프 염기-아연(II) 화합물의 형성을 불리하게 하나, 다른 분석물의 초과 조건은의 경우 쉬프 염기-아연(II) 화합물 형성에 미치는 영향은 아미노산과 아연 (II) 이온 사이의 친화력에 의존하는 것으로 보였다.
2장에서는 살리실알데하이드와 유사한 물질들을 이용한 아연(II)-쉬프 염기 화합물 형성에 대한 연구를 수행하였다. 아미노산 성분은 라이신으로 고정하고 대신에 다른 다양한 살리실알데하이드 유사체; [$X-C_6H_3(OH)(CHO)$] -X = -H, -F, -$NO_2$, -Me, -OH, O-anisaldehdye [$C_6H_3(OMe)(CHO)$], 2-hydroxy-1-naphthaldehyde [$C_{10}H_6(OH)(CHO)$]를 이용 한다는 점 이 외에는 실험 방법과 조건에 있어서 제 1장과 동일하였다. 생체 내에 적용하기에 더 적합하고 높은 효율을 내는 형광체(fluorophore)를 찾고자 실험을 수행하였으나, 오직 5-Fluorosalicylaldehyde 만이 비록 약하기는 하나 상대적으로 살리실알데하이드와 견줄만한 형광 세기를 나타냈다. O-anisaldehyde의 이용은 -Me 의 존재가 그 알데하이드 자체의 형광의 세기를 증가시키나 쉬프 염기-아연(II) 화합물 형성을 일어나지 못하게 함을 보였다. 이 실험에서 이용 된 아로마틱알데하이드는 쉬프 염기-아연(II) 화합물 형성에 있어 살리실알데하이드 보다 좋은 형광체로서의 잠재력을 보이지 못했지만, 여기서 얻은 데이터들은 다른 센서 구현을 위한 설계에 유용한 데이터로 이용될 수 있을 것으로 기대한다.
제 3장에서는 2-formylphenyl boronic acid pinacol ester (2-FPBPE)와 $H_2O_2$에 기반한 4 성분-혼합물 시료로부터 쉬프 염기-아연(II) 화합물 형성이 유도 될 수 있는지 형광 측정을 통하여 확인하였다. 살리실알데하이드, 라이신, 아연(II)에 기반한 3 성분-혼합물로부터 나타나는 청색 형광($(λ_{em,max} = 451-53 nm, λ_{ex}= 326-7 nm)$) 세기에 비하여 어떤 적정법에서든 그 4 성분-혼합물로부터 나타나는 청색 형광의 세기 ($λ_{em,max}= 452, λ_{ex} 326 nm$)는 현저히 낮았다. 그러나 이 실험은 4 성분-혼합물에서도 자발적으로 쉬프 염기-아연(II) 화합물이 형성 될 수 있고, 처리 된 $H_2O_2$ 양에 비례하여 증가하는 청색 형광 세기를 확인함으로써 이 4 성분에 기반한 방식이 $H_2O_2$의 양 또는 $H_2O_2$와 아연(II) 이온의 양을 동시에 지표 수 있는 센서로의 발전 가능함을 보였다.
