An enzyme stimulated deposition of Prussian blue (PB) onto gold-coated magnetic microparticles (MMPs) is described. We synthesize a continuous outer gold layer on MMPs for a gold working electrode and evaluate its superparamagnetic properties. The gold-coated MMPs offered an adhesive layer for the immobilization of glucose oxidase, catalyzing the generation of PB in the presence of glucose. The assembled PB on the gold shell surfaces was detected with electrochemical measurements. Recording a linear response from 0.2 to 10 mM of glucose, the applicability of magnetic core-gold shell structures to an electrochemical bioassay has been successfully demonstrated.
널리 알려져 있는 성인병인 당뇨병의 진단 및 예방으로 혈중 포도당(glucose)의 양을 측정하는 방법은 매우 중요하며, 실제로 고감도의 글루코스 바이오센서를 제작하기 위한 많은 연구들이 진행되어 왔다.
본 연구에서는 마이크로 사이즈의 자성입자에 금 박막을 입히고, 금 표면에 공유결합으로 효소를 고정시켜, 효소의 전자전달 반응을 사용하여 전기화학적으로 활성을 가지는 콜로이드 상태의 침전물을 금 표면에 증착 시켜 이를 글루코스 농도에 따라 전기화학적으로 측정하는 방식의 센서를 제작하였다.
자성입자에 금을 코팅하기 위한 단계는 두 단계로 첫째, seed가 되는 gold nanoparticles을 붙이는 단계 둘째, 금 이온을 seed-mediated growth방식으로 자성입자 표면에서 환원시키는 단계이다. 전기화학적 신호를 얻기 위해서는 마이크로 사이즈인 자성입자 표면에 금 박막이 최대한 균일하고 촘촘하게 연결되어 있어야 하기 때문에 이를 위해서, 금 이온의 환원과정 중 염의 유무, 환원제의 종류, 금 이온의 농도, 환원횟수, 온도 등의 조건을 변화시켜 컨트롤 실험을 수행 하였다. 이렇게 합성된 iron oxide core/gold shell 구조의 입자는 전자현미경으로 표면의 이미지 및 성분을 분석해 확인하는 단계를 거쳤다. 또한 표면의 금 박막이 전기화학적으로 전도성을 가지는지 알아 보기 위해 산화 환원 측정 순환 전압전류 (CV)를 통해 금 표면과 전극과의 전자전달 반응을 확인하고, 센서로서의 응용가능성을 검증하였다.
이렇게 만들어진 자성입자의 금 표면에 효소를 공유결합으로 고정시키고, 효소가 특정 파장에서 흡광을 보인다는 성질을 이용하여 금 표면에 고정된 효소의 양을 측정 및 확인하였다. 금 표면에 고정된 효소의 전자전달 반응을 통해 글루코스를 산화시키면서 전자전달 매개체로 사용된 ferricyanide에 전자를 전달해 ferrocyanide로 환원 된다. Ferrocyanide 는 $Fe^{3+}$ 와 반응하여 전기화학적으로 활성을 가지면서도 콜로이드 상태의 침전물로 존재하는 프러시안 블루를 만든다. 즉, 프러시안 블루는 글루코스의 농도에 따라 자성입자 표면의 금 박막 위에서 나노 입자 상태로 자라나게 된다. 여기서 자성입자 표면에 코팅된 금 박막은 효소 고정을 위한 기판일 뿐 아니라 효소반응 생성물인 프러시안 블루 입자가 자라나기 위한 층으로서도 작용한다. 글루코스 농도에 따라 생겨난 프러시안 블루의 양을, 산화 환원 측정 순환 전압전류 (CV) 및 네모파 전압전류법 (SWV) 으로 특정 전위에서 나타나는 프러시안 블루의 전류 값을 측정 해 글루코스의 농도에 따른 선형감응을 얻었다. 본 연구에서는 200 μM 까지의 글루코스의 양을 양을 측정할 수 있었고, 특히 단위면적당 일반 금 전극에서 프러시안 블루를 생성시킨 것 보다 3배 이상의 전하를 생성하는 것으로 나타났다.
본 연구의 새로운 방법은 금 박막이 입혀진 자성입자를 통해서 효소반응을 시킴으로써 기존의 금 전극 표면에서 효소반응을 시키던 시스템과는 차별화된 방식으로, Glucose Oxidase 를 표지로 하는 다른 분자의 검출에도 유용하게 적용 할 수 있는 가능성을 제시하였다.
