The potential of induced pluripotent stem cells is enormous, but many obstacles should be overcome remain before their medical and pharmaceutical applications can be fully realized. To address the safety issues arose from harboring integrated exogenous sequences in the target cell genome, a number of modified genetic methods have been developed and produced induced pluripotent stem cells with potentially reduced risks. However, all of the methods yet developed involve the use of genetic materials and thus the potential for unexpected genetic modifications by the exogenous sequences in the target cells.
Recently one possible way to avoid introducing exogenous genetic modifications to target cells was reported. They deliver the transcriptional proteins directly into cells by conjugating them with a short peptide that mediates protein (protein transduction domains; PTD) transduction, such as poly-arginine, In contrast to virus- or gene-based methods, the reprogramming factors were not provided continuously and thus were in short supply. Therefore, they chose repeated protein treatment cycles every 2 day or 16 hrs. The efficiency of induced pluripotent stem cells generation is 10 times lower using this protein based protocol (about 0.001% of input cells), compared to virus-based protocols (about 0.01% of input cells). The gene vector-free, direct protein transduction system eliminates limitations that may be caused by viral or any other gene-based reprogramming methods. However, the generation of protein-based induced pluripotent stem cells is very slow and inefficient and requires further optimization.
In this study, we suggested a delivery system transfer transcriptional factors into cell more effective than PTD system. Requisites for the delivery system carrier are cell membrane permeability (nanomaterials), having wide space to load material, low cell toxicity. Nanomaterials have drawn particular attention their small and uniform dimension to apply biological field. Nanotubes having inner space rod like straw bundles and showing cell membrane permeability, it is good a candidate carrier for delivery system. Carbon nanotube is one of famous nanomaterials having many applications in biology but it has cell and tissue toxicity with small amounts. Anodic aluminium oxide (AAO) nanotubes could be obtained highly ordered structure with an almost ideal hexagonal arrangement over relatively large areas in acid solution easily. For many decades, researchers have believed that there is a link between aluminium and Alzheimer`s disease and have claimed a number of other circumstantial links between them. I counted out the carbon and aluminum oxide nanotubes for carrier materials in case this system uses clinical therapy.
In this study, I showed what the key factors to make titanium oxide nanotube are in aqueous and organic solutions and examined whether transcription factors and nanotubes conjugations could induce pluripotency in somatic cells. Aminosilane modified inner and outer surface of nanotube could attach to transcriptional factor proteins. As mentioned above, short peptide is needed that mediates protein transduction into the cell. While the protein by itself cannot enter cells, it readily enters cells when conjugated to a nanotube transporter. It is first time that transcriptional factor proteins (not fluorescent) are delivered in cell by carriers and investigate the response of cell. In addition, the nanotube structure may act as a physical shield for the inserted proteins and provide advantages for protein delivery. Nanotube-protein conjugation could be an excellent protein delivery system to reprogram of somatic cell for their transduction efficiency (80~90%, in this study) and protein protection function to reduce protein treatment cycles.
By combining four transcriptional factors, we will be able to generate induced pluripotent stem (iPS) cells, in near future, directly from mouse neural stem cell(m-NSC), mouse embryonic fibroblast(MEF), human NPC, human fibroblast.
배아줄기세포와 분화된 세포에 존재하는 단백질의 차이를 분석하여 줄기세포를 유지하게 만드는 전사인자 단백질을 바이러스를 이용하여 분화된 세포에서 발현시켜 얻은 역분화 줄기세포의 응용 가능성은 무한하지만, 이를 재생의학에서 응용하기 위해서 반드시 극복해야만 하는 여러 가지 문제점이 존재한다. 도입된 외래 유전자의 지속적인 발현으로 인한 세포의 암세포화되는 문제와 바이러스 유전자가 세포의 유전체에 삽입되는 문제를 해결하고자 이용되는 전사인자의 수를 줄이는 방법과 유전자를 전달하는 벡터를 전환하는 방법 등 몇 가지 개선방안이 제시되어 내재된 위험성을 줄이고 있으나, 대부분의 방법들이 외래 유전자를 사용한다는 점에서 예상하지 못하는 문제점을 일으킬 수 있다는 위험성을 내포하고 있다는 점은 해결되지 못했다.
최근에 외래 유전체를 도입하지 않고 분화된 세포를 역분화 하는데 필요한 전사인자를 세포막을 통과하는 짧은 펩타이드 (9~11개의 아르기닌)와 연결하여 이를 세포 내부로 운반하는 방법이 보고되었다. 바이러스나 유전자를 이용하는 방법과는 달리 전사인자를 직접 공급하는 방법이므로 전사인자의 지속적인 효과를 유지하기 위해 16시간이나 2일에 한번씩 꾸준한 공급이 필요했다. 전사인자 단백질을 이용한 역분화는 효율이 0.001%에 불과해 바이러스를 이용한 방법에 비해 10-100배 정도 낮았다. 외래 유전자를 이용하지 않고 단백질을 직접 세포로 넣어주는 방법은 역분화 줄기세포의 위험성을 크게 줄이는 방법이지만, 아직 제조 효율이 낮아 앞으로 최적화를 위한 연구가 필요하다.
본 연구에서는 단백질을 세포 내부로 전달할 운반체를 이용하여 단백질을 보다 효율적으로 삽입하여 단백질 전사인자를 이용한 역분화의 효율을 향상시키고자 하였다. 운반체가 갖춰야 할 특성은 세포막을 투과하여 내부로 쉽게 삽입될 수 있어야 하므로 크기는 수 마이크로 내외이며, 넓은 표면적을 가지고 있어 전달하고자 하는 단백질을 수용할 수 있어야 하고 세포독성이 없어야 한다. 이런 점에서 최근 각광받은 재료로 나노물질들이 좋은 대상이 될 수 있다. 나노물질은 그 형상에 따라 나노구, 나노막대, 나노튜브등으로 나누어지기도 하는데 일반적인 형태보다는 나노튜브가 내부에 공간을 보유하고 있어 전달물질 수용량 측면과 세포막 투과성과 더 우수한 기능을 할 것으로 사료된다.
나노튜브라고 하면 탄소나노튜브가 가장 일반적이지만, 우수한 기능성과 많은 연구에도 불구하고 비교적 적은 량에 세포와 조직에서의 독성이 많이 보고가 되고 있어 운반체 후보에서 배재하였다. 그 다음으로 잘 알려진 것은 양극산화 알루미늄(AAO)인데, 제조하는 기술적으로 거의 최고 정점에 달한 우수한 재료이다. 산 용액속에서 양전극에 알루미늄을 걸어주면 조건에 따라 경면이 형성되는 전기화학 연마가 되기도 하고 특이한 형태의 산화막 구조물을 형성하기도 한다. 하지만 알루미늄은 지난 수 십 년간 알츠하이머의 원인 중 하나라는 논쟁 속에 있어 임상을 위한 세포기술에 적용하기는 곤란하였다. 비록 세포의 계대가 몇 차례 이루어지면 확률적으로 세포속에 나노튜브는 없는 것으로 봐도 되지만, 논란 중에 있는 재료를 세포에 적용하지는 않았다.
십 년 전부터 양극산화 알루미늄 기술을 응용해 다른 재료들의 나노 산화물을 만들기 위한 노력이 이루어졌다. 이미 만들어진 양극산화 알루미늄을 틀로 이용해 찍어내는 방법이나, 금속을 이중으로 증착하고 알루미늄 나노튜브를 종자로 삼아 다른 금속의 산화물 나노튜브를 만들기도 하였다. 연구가 진행되면서 다른 금속들의 양극산화법의 조건들이 알려지면서 응용성이 높은 티타늄의 나노튜브 연구가 활성화 되었다.
티타늄은 이미 자외선 차단제로 수백 나노에서 수 마이크로 크기의 입자를 기능성 화장품으로 이용하고 있으며, 1960년대부터 치과와 정형외과에서 의료기기용으로 사용되고 있다. 상업적으로 40년간 가장 많은 생체 내 임플란트로 사용되고 있어 비록 세포가 아닌 조직에서의 문제이기는 하나, 독성반응이 적은 재료로 판단된다.
본 연구에서는 양극 산화법을 이용한 산화 티타늄 나노튜브 형성에 있어 주요 공정변수를 수용액과 비수용액으로 나누어 구분하여 확립하였다. 장점이기도 하지만 티타늄의 낮은 반응성으로 인해 티타늄 나노튜브 와 전사인자 단백질간의 결합을 위해 추가적으로 솔-젤법을 이용한 이산화규소막을 형성하고 그 표면에 아미노실란으로 양전화막을 형성하였다. 나노튜브에 형성된 표면전하를 이용하여 나노운반체에 부착된 단백질 전사인자는 세포막을 통과하여 (본 실험에서는 80~90%의 세포막 투과율을 보임) 세포 내부로 들어감을 확인하였다. 이를 통해 제작한 나노튜브-전사인자 단백질은 세포 내부로 단백질을 전달하는 운반체로 응용 가능함을 확인하였다. 뿐만 아니라 나노튜브 구조는 다른 구형의 나노 운반체와 달리 세포내부에서 운반된 물질의 보호막이 되어 빠른 분해를 막아 주는 효과를 보여 전사인자 단백질 처리 횟수를 줄일 수 있는 서방형 운반체로 좋은 예가 될 것으로 사료된다. 산화티타늄에 양자점과 형광 단백질을 전사인자 단백질을 부착하는 방법과 동일하게 준비하여 세포에 처리한 결과 세포질에 자리한다는 것을 확인하였다.
본 연구의 결과로 전사인자 단백질의 운반체로 산화 티타늄 나노튜브를 사용하여 역분화 줄기세포의 형성 가능성을 보였다. 하지만, 본 연구에 이용된 전사인자 단백질은 안정적인 수명이 짧아 단백질의 분해가 쉽게 발생되는 문제를 가지고 있었다. 유전자 재조합으로 얻은 단백질 전사인자는 아미노산 서열이 비 수용성인 경우가 많아 합성 단계에서도 그 양이 적게 얻어지고 짧은 시간에 변성이 쉽게 일어나는 등 안정성이 낮았다. 변성으로 인한 전사인자 단백질의 기능 소실을 막을 수 있는 보관과 사용 문제를 극복하는 것이 가장 중요한 과제로 대두되었다. 향후 이러한 문제를 극복한다면 전사인자 단백질을 나노튜브에 부착하여 세포에 처리하는 방법으로 효율이 뛰어나고 임상에 적용이 가능한 역분화 줄기세포를 형성할 수 있을 것으로 기대한다.
