Isothermal nucleic acids amplification method has been a good alternative technique to polymerase chain reaction (PCR) for an achievement of point-of-care testing (POCT) or disease diagnosis. Particularly, due to the fact that it does not require any complicated equipment such as a thermal cycler and it exponentially amplifies target sequence in a short time, rapid, simple and sensitive target detection could be achieved. Additionally, as signaling methods such as fluorescent or colorimetric assay can be easily incorporated into isothermal amplification due to consistent temperature condition, it is applied to the sensitive and desirable detection of biologically important molecules. In this study, both the isothermal nucleic acids amplification methods for the genetic diagnosis including sexually transmitted diseases and for the detection of antigens were described.
An iTPA (isothermal target and signaling probe amplification) method for the quantitative detection of nucleic acids, based on a combination of novel ICA (isothermal chain amplification) and FRET CPT (cycling probe technology), is described. In the new ICA method, two displacement events occur in the presence of four specially designed primers. This phenomenon leads to powerful amplification of target DNA. Since the amplification is initiated only after hybridization of the four primers, the ICA method leads to high specificity for the target sequence. As part of the new ICA method, iTPA is achieved by incorporating FRET CPT to generate multiple fluorescence signals from a single target molecule. By using the resulting dual target and signaling probe amplification system, even a single copy of a target gene can be successfully detected and quantified under isothermal conditions.
A facile gold nanoparticle (AuNP)-mediated colorimetric method for real-time detection of target DNA in conjugation with our unique isothermal target and signaling probe amplification (iTPA) method, comprising novel ICA (isothermal chain amplification) and CPT (cycling probe technology) is described. The intact gold nanoparticle cross-linking assay (GCA) probes were designed to cross-link two sets of DNA-AuNPs conjugates in the absence of target DNA, inducing aggregation (blue color) of AuNPs. On the contrary, the presence of target DNA leads to cleavage of the GCA probes in proportion to the amount of amplified target DNA and the solution remains red in color without aggregation of AuNPs. Relying on this strategy, 102 copies of target Chlamydia trachomatis plasmid were successfully detected in a colorimetric manner. From the results achieved, the isothermal amplification methods for the detection of nucleic acids would be widely used as a powerful detection method for clinical diagnosis field.
1983년 Kary Mullis에 의해 개발된 핵산증폭 기술인 중합효소연쇄반응(PCR) 기술은, 클론닝, 시퀀싱과 더불어 20세기 가장 큰 기술적, 경제적 가치와 파급효과를 지닌 생명공학 기술로 평가되고 있으며 분자생물학 전체에 일대 변혁을 일으켜 주었다. 극히 적은 양의 핵산 시료를 간편하게 대량으로 증폭할 수 있다는 장점 때문에 유전자 클로닝(cloning), 염기서열 분석(sequencing), 유전병 진단, 유전자 지문 분석, 전염병 진단 등 생명공학 전 분야에서 기본 핵심 기술로 응용되어왔다.
이러한 PCR방법은 온도 변화를 기반으로 하기 때문에 온도조절장치 (Thermocycler)를 반드시 필요로 한다. 따라서, 향후 시료에서 결과까지 분석 수행자 없이 진행되는 현장진단 (POCT, point-of-care testing)을 목적으로 하는 미세유체제어 (microfluidics) 기술 등이 융합된 랩온어칩 (LOC, lab-on-a-chip) 또는 미세종합 분석시스템 (μTAS, micro total analysis system)에 적용하기 어렵다는 치명적인 단점이 있다. 또한 고열이 수반되는 반응이므로 사용 가능한 효소 등이 제한적이며, 증폭 시간도 오래 걸린다는 단점도 수반한다. 이와 같은 문제를 극복하고 현장진단 시스템에 적용할 수 있게 하는 기술이 바로 등온 핵산증폭 기술이다.
그 동안 다양한 종류의 등온 핵산증폭 기술들이 개발되어왔다. 그 예로써, transcription-mediated amplification (TMA), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), single primer isothermal amplification (SPIA), isothermal chimeric primer-initiated amplification (ICAN), strand displacement amplification (SDA), helicase-dependent amplification (HDA), rolling circle amplification (RCA) 그리고 loop-mediated amplification (LAMP) 방법들이 있다. 그러나 이러한 방법들은 부분적으로 낮은 민감도, 낮은 특이성, 반응의 복잡성 그리고 복잡한 primer 디자인 이라는 문제점들을 가지고 있다. 따라서 이런 부분들을 해결 할 수 있는 등온 핵산증폭 기술의 개발이 요구된다.
제기된 문제점들을 극복하는 새로운 등온 핵산 증폭 기술을 개발하기 위해서, denaturation 방법을 다양화 하는 연구를 하였다. 첫 번째로, isothermal target and probe amplification (iTPA) 방법을 개발하였다. 이 방법은 증폭 방법인 isothermal chain amplification (ICA) 과 정량 방법인 cycling probe technology (CPT) 가 결합된 형태이다. ICA 에서는, RNA-DNA duplex에서 RNA만 선택적으로 자르는 RNAse H 활성과 DNA polymerase 의 displacement 활성을 이용한denaturation 방법을 도입하였다. 또한, outer primer 와 DNA/RNA/DNA 로 된 inner primer 를 이용하여, 2 종류의 증폭 루트를 생성시켜 높은 증폭 효율을 이루어냈다. 증폭 기술에 정량 기술을 접목하기 위해서, CPT 기술을 도입하였다. CPT 기술은, 표적물질이 있을 경우에만 CPT probe (DNA/RNA/DNA)가 표적 핵산과 결합하여 RNAse H에 의해 잘리면서 두 가닥의 DNA로 분리되어 떨어지고, 다시 새로운 CPT probe의 절단이 반복되는 시스템이다. CPT probe의 한쪽 끝에는 형광물질을 표지되어 있고, 다른 한쪽에는 quencher 물질이 표지되어 있기 때문에 시간이 지날수록 형광 신호가 증가 하게되는 시스템이다. 따라서 FRET CPT 시스템을 ICA와 결합하여 표적 핵산 (Chlamydiae Trachomatis) 을 1 copy 까지 진단하는 등온 핵산증폭 기술을 개발하였다.
실제적인 현장진단이 이뤄지기 위해서는, 복잡하거나 전문적인 기술이 요구되는 시스템으로는 힘들다. 따라서, 많은 연구자들은 색변이를 이용한 간편한 현장진단 시스템을 구축하는 노력을 많이 해오고 있다. 색변이를 통하게 되면, 전문가의 도움 없이, 색의 변화를 통해서 샘플의 양성 유무를 손쉽고 빠르게 판단을 할 수 가 있다. 이러한 색변이 시스템에 많이 쓰이는 물질로는 금 나노 입자를 들 수 있다. 이 물질은 크기에 따라서 색이 다르기 때문에, 표적 물질이 있을 때 색이 변하는 시스템을 이용한다면, 쉽고 빠르게 진단을 할 수 가 있다. 이러한 요구에 맞춰서, 기존에 개발한 iTPA 시스템을 gold nanoparticle cross-linking assay (GCA) 와 접목을 해서, 표적 핵산 (Chlamydiae Trachomatis) 진단을 100 copy 까지 할 수 있는 시스템을 개발하였다.
본 연구를 통해서 기존의 전문적이고 고가의 실험장비를 필요로 하는 증폭 및 분석방법의 한계를 극복하였다. 간편한 water bath 나 heat block 만을 이용해서, 90 분 내에 표적 핵산을 민감하게 진단할 수 있는 새로운 증폭 방법을 개발함으로써, 향후 유전병 또는 전염병 등의 조기 진단 및 조기 치료를 위한 빠르고 간편한 POCT 로의 응용이 기대된다.
