Gastric cancer, the fourth most frequent cancer and the second leading cause of cancer death in the world, is a complex disease caused by multiple genetic and environmental factors. It is categorized into two distinct subtypes, diffuse- and intestinal-type gastric cancer according to Lauren’s classification. Whereas diffuse-type gastric cancer (DGC) is charac-terized by poorly-differentiated adenocarcinoma, infiltrative growth pattern and balanced incidence in gender and population, intestinal-type gastric cancer (IGC) is characterized by well-differentiated adenocarcinoma, expansive growth pattern and biased incidence in gender and population. Because of the differences between IGC and DGC, it is important to identify the genetic factors specifically underlying each subtype, but such factors have not yet been fully elucidated.
To discover genes and genetic variations specifically associated with susceptibility to gastric cancer subtypes, a case-control association study was performed in our laboratory by genotyping 865 unrelated Korean subjects for a total of 524 single-nucleotide polymor-phisms (SNPs) from 98 genes which were selected according to following two categories; (1) Genes whose expression levels are significantly different between normal tissues and gastric cancer tissues, (2) Genes within genome instability loci in gastric cancer. Eleven SNPs from nine genes (RUNX3, ANKRD9, EEF1D, LOC729626, ARF1, AUH, CORO1B, SERPINE1 and DLD) showed significant association with susceptibility to gas-tric cancer subtype (P < 0.05). In this study, I further investigated the genetic association and functional implications of two IGC susceptibility genes, RUNX3 and ANKRD9 among 9 associated genes.
The runt-related transcription factor RUNX3 plays essential roles in various types of tu-mors, including gastric cancer. Epigenetic changes in the methylation of the RUNX3 prox-imal promoter, but not genetic changes in RUNX3, have been associated with changes in gene expression and the cancer development. Here, several SNPs in RUNX3 are significant-ly associated with susceptibility to IGC (0.0028 ≤ P ≤ 0.022) but not DGC (0.70 ≤ P ≤ 0.96). The risk-associated (minor) variant of an IGC-associated SNP in the RUNX3 distal promoter (rs7528484) significantly increased promoter activity in a CREB1-dependent manner (P = 0.0059). The distal promoter-derived, 33-kDa isoform of RUNX3 increased the activity of NF-kB (P = 0.00026), which is activated by Helicobacter pylori infection, a risk factor for IGC, and the expression of IL-1b, an NF-kB target (P = 0.048). In contrast, the proximal promoter-derived, 44-kDa isoform of RUNX3 decreased both NF-kB activity (P = 0.019) and IL-1b expression (P = 0.0011). Therefore, genetic changes in the RUNX3 distal promoter contribute to IGC susceptibility by increasing promoter activity and thus increasing levels of the 33-kDa isoform of RUNX3, resulting in increased NF-kB activity and IL-1b expression. This effect can also be achieved by down-regulation of the 44-kDa RUNX3 isoform, the transcription for which may be decreased by hyper-methylation of the RUNX3 proximal promoter.
Ankyrin repeat domain 9 (ANKRD9) is a novel gene differentially expressed in compari-son between gastric cancer tissues and normal tissues from microarray results, suggesting it as one of gastric cancer candidate genes. By examining genetic variations selected from the ANKRD9 flanking region, we found that ANKRD9 is significantly associated with intestin-al-type gastric cancer (IGC) susceptibility. A dinucleotide polymorphism (DNP) in the ANKRD9 promoter showed the most significant association with the IGC risk (P = 0.000085, OR = 2.27). Moreover, a nonrisk allele of DNP has 1.89-fold higher promoter activity than risk allele (P = 0.00089), hypothesizing the inverse relationship between ANKRD9 expression level and cancer risk. Supporting this hypothesis, ANKRD9 knock-down accelerated cell proliferation and anchorage-independent growth, the hallmarks of cancer. Also, ANKRD9 was down-regulated by the activation of the central cancer signaling pathways MAPK and mTOR, raising the possibility that ANKRD9 down-regulation may be a common event of cancers. Indeed, decreased ANKRD9 expression level was reproducibly observed in multiple cancers. Furthermore, microarray-based gene expression profiling re-vealed that stable ANKRD9 knockdown dramatically up-regulated the expression level of several malignancy-related genes. Therefore, our findings indicate that ANKRD9 is a pre-viously unrecognized tumor suppressor affected by genetic alterations and transcriptional inactivation. In addition, we propose that ANKRD9 is likely to be involved in the link be-tween cancer and lipid metabolism.
In conclusion, this is the first report to show the genetic association and functional relev-ance of RUNX3 and ANKRD9 with IGC susceptibility. These findings demonstrate novel possibilities to understand the molecular mechanism underlying IGC pathogenesis and to develop therapeutic targets for IGC.
위암은 전세계적으로 4번째로 빈번히 발생되는 암이며, 2번째로 많은 암관련 사망을 일으키는 복합 질환이다. 로렌의 분류법에 따르며, 위암은 크게 미만형, 장형 위암으로 구분된다. 미만형 위암은 분화 상태가 명확하지 않은 선암종으로서 침습적인 성장 패턴을 보이는 반면, 장형 위암은 분화가 명확한 선암종으로서 확장형 성장 패턴을 보이는 것으로 알려져 있다. 이러한 조직학적, 병리학적 차이는 두 가지 위암 타입이 유전적으로 다를 것이라는 사실을 단적으로 보여주지만 현재까지 많은 유전 요소들이 밝혀지지 않았다.
본 연구는 위암 세부 타입에 특이적인 신규 유전자 및 변이를 발굴하고자, 위암에서 특이적 발현 변화를 가지면서 유전체가 흔히 소실되거나 증폭되는 98개의 후보 유전자를 선별한 후865 명의 한국인 샘플에서 524개의 단일서열 다형성의 유전자형을 분석하였다. 총 9개 유전자의 11개 단일서열 다형성에서 위암 세부타입 특이적 연관성을 발견하였으며, 본 연구에서는 2개의 장형 감수성 유전자 RUNX3, ANKRD9에 대하여 초점을 맞추었다.
RUNX3는 위암을 포함한 다양한 암에서 중요한 역할을 하는 유전자로 알려져 왔다. 현재까지 RUNX3의 후성 유전적인 차이가 이 유전자의 발현 및 위암 발생과 연관이 있다는 결과가 알려졌으나, 유전 변이와 발현, 위암 사이의 연관성은 연구가 되지 않았다. 본 연구는 RUNX3에서 장형 위암 감수성을 보이는 유전변이들을 발견하였다 (0.0028 ≤ P ≤ 0.022). 특히, RUNX3 distal promoter의 단일서열 다형성 rs7528484는 프로모터 활성도를 전사인자 CREB1 에 따라서 영향을 주었다 (P = 0.0059). distal promoter에 의해 생성되는 33-kDa RUNX3 isoform 는 위암의 위험인자인 헬리코박터 파이롤리에 의해 활성화되는 NF-kB (P=0.00026) 와 그 타겟 물질인 IL-1b (P = 0.048) 의 발현을 증가시켰다. 반면 proximal promoter에 의해 생성되는 44-kDa RUNX3 isoform는 NF-kB 활성화 (P = 0.019) 와 IL-1b 발현 (P = 0.0011) 모두를 감소시켰다. 그러므로 RUNX3 distal promoter의 유전변이는 프로모터 활성화에 영향을 줌으로써 NF-kB 활성화 와 IL-1b 발현을 증가시키는 33-kDa RUNX3 isoform의 생성을 증가시키고, 결과적으로 장형 위암 감수성을 일으킴을 확인하였다.
ANKRD9는 위암에서 발현이 억제되는 신규 위암 후보 유전자로서 이 유전자 주변의 유전 변이에서 장형 위암 연관성을 발견하였다. 특히, ANKRD9 프로모터에 있는 이서열 다형성에서 강한 장형 위암 특이적 신호와 (P = 0.000085, OR = 2.27) 프로모터 활성화 조절 기능 (P = 0.00089)을 확인하였다. 이서열 다형성의 위험 대립형질은 프로모터 활성을 떨어뜨리는 기능을 가지고 있으므로 본 연구에서는 ANKRD9 발현과 위암 위험도가 반비례 관계임을 가질 것이라는 가설을 설립하였고, 이에 대한 후속 기능 연구를 수행하였다. ANKRD9 유전자의 shRNA를 통한 발현 억제는 암의 특징인 세포 증식과 부착-독립적 성장을 촉진시켰다. 또한 ANKRD9 의 발현은 중추적인 암 신호 MAPK 와mTOR의 활성에 의해서 억제되었으며, 위암을 비롯한 다양한 종류의 암에서 빈번히 억제됨을 관찰하였다. 이는 ANKRD9 의 발현 억제가 다양한 암의 공통적인 현상임을 보여 주었다. ARNKD9의 shRNA를 통한 발현 억제 후 마이크로어레이 분석은 다양한 암 관련 마커 유전자들의 발현을 증폭시켰다. 그러므로 본 연구는 ANKRD9는 신규 암 억제 유전자로서, 이 유전자의 유전 변이와 발현 억제가 장형 위암 감수성 및 암 관련 특징들을 일으키는 기작임을 확인하였다.
결론적으로 본 연구를 통해RUNX3의 장형 위암 연관 유전 변이와, 장형 위암 유전자 ANKRD9을 신규 발굴하였다. 이는 장형 위암 발병의 새로운 분자적인 기작과 치료용 타겟의 발굴 가능성을 제시한다.
