Xylitol, a five-carbon sugar alcohol, is used as an alternative natural sweetener in the food and confectionary industry. It has an anticariogenic effect with the same order of sweetness as sucrose and can replace sucrose on an equal weight basis. As it does not require insulin for metabolic regulation, it can be used as an insulin-independent sugar substitute for diabetics.
Xylose reductase (XR) is the key enzyme in xylitol production, catalyzing the reduction of D-xylose to xylitol. The formation of XR in Candida tropicalis is significantly repressed in cells grown on medium containing glucose as carbon and energy sources, probably due to glucose repression. This is one reason why glucose is not a suitable cosubstrate for supporting cell growth for xylitol production. Although Neurospora crassa XR (NcXR) has high catalytic efficiency, NcXR was not expressed in C. tropicalis because of different codon usage between the two species. The NcXR codons were changed to the codons preferred in C. tropicalis. The codon-optimized NcXR gene (NXRG) was placed under the control of a constitutive glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter derived from C. tropicalis and integrated into the genome of xylitol dehydrogenase gene (XYL2)-disrupted C. tropicalis. The high level of expression of NXRG was confirmed by determining the enzyme activity in cells grown on glucose medium. The resulting recombinant yeast, C. tropicalis LNG2, showed high XR activity (2.86 U (mg of protein)-1), whereas no activity was detected in the parent strain, C. tropicalis BSXDH-3. In xylitol fermentation using glucose as a cosubstrate with xylose, LNG2 produced xylitol at a rate of 1.44 g $L^{-1} h^{-1}$) and a xylitol yield of 96% in 44 h. Compared with a xylitol production rate of 0.83 g $L^{-1} h^{-1}$) and xylitol yield of 59% in BSXDH-3, these values were 73% and 62% higher than those of BSXDH-3, respectively.
XRs in most yeasts and filamentous fungi have evolved to have broad substrate specificity for efficient reduction of a number of sugar molecules. The broad substrate acceptance of XR could adversely affect the biological production of xylitol. The hemicelluloses, major sources of xylose, also contain abundant L-arabinose and it can be reduced to arabitol, an undesirable byproduct. Arabitol, epimer of xylitol, is difficult to remove, and interferes with xylitol crystallization in downstream process. C. tropicalis XR (CtXR) also have a higher activity for L-arabinose than D-xylose, and this substrate specificity causes the formation of arabitol. To change substrate specificity of XR, L-arabinose-preferring endogenous CtXR was replaced by D-xylose-preferring heterologous XR in C. tropicalis. Firstly, the L-arabinose-preferring endogenous CtXR genes (XYL1) were disrupted in XYL2-disrupted C. tropicalis. The five point mutations were introduced to NXRG to improve substrate selectivity for D-xylose. Then, the D-xylose-preferring mutated NXRG was integrated into the XYL1 and XYL2-disrupted strain and functionally expressed. The preference for D-xylose increased significantly in resulting strain KN-Mut5, and arabitol formation decreased by 32%, compared with control strain.
The bacterial L-arabinose utilization pathway was introduced to C. tropicalis for additional repression of arabitol formation. For the heterologous expression, the genes of Bacillus licheniformis L-arabinose isomerase, Escherichia coli L-ribulokinase, and E. coli L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase were codon-optimized using the preferred codons in C. tropicalis. To minimize flux from L-arabinose to arabitol, L-arabinose-preferring endogenous XR was replaced by D-xylose-preferring heterologous XR in C. tropicalis, and then codon-optimized genes were functionally expressed. The heterologous expression of L-arabinose utilization enzymes in C. tropicalis was demonstrated by the presence of the corresponding mRNAs in the resulting strain JY. In fed-batch culture, JY consumed L-arabinose of 10.5 g/L without forming arabitol, and JY showed 16% higher xylitol productivity (0.64 g $L^{-1} h^{-1}$)) than control strain (0.55 g $L^{-1} h^{-1}$)).
Xylitol fermentation with C. tropicalis JY was performed in a 2.5-L jar fermenter containing 1 L of fermentation medium. The ratio of D-xylose to L-arabinose in the fermentation medium was identical with corncob hydrolysates. JY produced xylitol with a volumetric productivity of 1.50 g $L^{-1} h^{-1}$) and a yield of 95%. Although L-arabinose was completely consumed, arabitol was not formed.
자일리톨 (xylitol)은 오탄당 알코올로서 설탕과 유사한 감미도를 가지고 있으면서 열량이 낮고 충치 예방 효과를 가지고 있기 때문에 산업적으로 그 이용이 증가하고 있다. 또한 인슐린에 관계없이 대사되기 때문에 당뇨병 환자의 대체 감미료로서 이용되고 있다. 현재 자일리톨은 바이오매스 산가수분해물에서 정제된 자일로스 (xylose)로부터 화학적 수소첨가반응을 통하여 생산되고 있다. 그러나 화학적인 생산 방법은 자일로스 분리정제과정에서 많은 비용이 요구되며, 수소가스와 니켈촉매의 사용 및 고온·고압의 공정은 위험과 환경오염을 초래한다. 따라서 그에 대한 대안으로 생물학적 자일리톨 생산기술이 연구되고 있으며, 특히 자일로스 이용능력이 뛰어난 효모 균주인 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis)가 자일리톨 생산균주로 주목받고 있다.
자일로스 환원효소 (xylose reductase; XR)는 NADPH의 산화를 동반하여, 자일로스를 자일리톨로 전환시키는 효소이다. 캔디다 트로피칼리스는 우선적으로 포도당을 먼저 이용하기 위해 포도당이 존재하는 조건에서는 자일로스 환원효소의 합성을 억제하고 있는데, 이는 포도당을 보조기질로 이용하여 자일리톨을 생산하는데 문제점으로 작용한다. 따라서 포도당을 보조기질로 이용하여 자일리톨을 생산하기 위해서 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)의 자일로스 환원효소 (NcXR)를 계속적으로 발현시켜 자일로스 환원효소에 대한 포도당의 억제 효과를 무력화하였다. NcXR은 높은 활성을 가지고 있다는 장점을 가지고 있지만, 캔디다 트로피칼리스와 이용하는 코돈 (codon)이 상이하여 발현되지 않는다는 문제가 있다. NcXR을 발현시키기 위하여 코돈 최적화 (codon optimization)를 수행하였으며, 포도당 존재하에서도 발현시키기 위해 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 프로모터 (promoter)를 이용하였다. NcXR과 GAPDH 프로모터가 포함된 카세트가 캔디다 트로피칼리스 균주에 도입되었으며, 구축된 균주인 LNG2는 44시간 동안 73% 증가된 자일리톨 생산속도 (1.44 g $L^{-1} h^{-1}$)와 62% 증가된 수율 (96%)을 보여주었다.
대부분의 효모나 곰팡이의 XR은 많은 당을 효과적으로 이용하기 위해 넓은 기질 특이성을 갖도록 진화되어 왔다. 자일로스의 원료가 되는 헤미셀룰로스 (hemicellucose)는 자일로스 뿐만 아니라 상당량의 아라비노스 (L-arabinose)를 포함하고 있기 때문에, XR의 넓은 기질 특이성은 아라비노스까지 아라비톨로 전환시키게 된다. 아라비톨은 자일리톨의 에피머 (epimer)로서 분리하기 어렵고, 자일리톨의 결정화를 방해하여 생산수율을 저하시키는 부산물로서 작용한다. 캔디다 트로피칼리스 균주의 XR (CtXR)은 오히려 자일로스보다 아라비노스에 높은 기질 특이성을 보여주고 있으며, 이는 자일리톨 생산시 부산물인 아라비톨의 생성을 초래하게 된다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 아라비노스에 높은 활성을 보이는 기존 캔디다 트로피칼리스의 XR 유전자를 제거하였으며, NcXR로부터 유래된 자일로스에 높은 활성을 보이는 XR을 캔디다 트로피칼리스에서 발현시켰다. 구축된 균주인 KN-Mut5는 32% 감소된 아라비톨 생성량을 보여주었다.
추가적인 아라비톨 생성 억제를 위해, 박테리아의 아라비노스 대사경로를 캔디다 트로피칼리스에 도입하였다. 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis)의 L-arabinose isomerase와 대장균 (Escherichia coli)의 L-ribulokinase및 L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase 가 코돈 최적화 되어 캔디다 트로피칼리스에서 발현되었으며, 구축된 균주인 JY는 아라비노스를 탄소원으로 이용하여 생장하는 것이 확인되었다. 자일로스와 아라비노스의 혼합배지를 이용한 자일리톨 생산실험에서 JY는 10.5 g/L의 아라비노스를 소모하였지만, 아라비톨은 생성되지 않았다. 또한 아라비톨에 사용될 NADPH가 자일리톨 생산에 이용되어 16% 증가한 자일리톨 생산성 (0.64 g $L^{-1} h^{-1}$))을 보여주었다. 2.5-L발효기에서 옥수수속대 가수분해물과 동일한 자일로스 대 아라비노스 비율을 가진 배지를 이용하여 자일리톨을 생산한 결과, JY는 1.50 g $L^{-1} h^{-1}$)의 자일리톨 생산성과 95% 의 수율을 보여주었으며, 아라비톨 생성없이 아라비노스를 모두 소모하였다.
