Mammalian cells are commonly used for the production of antibodies and other therapeutic proteins. Mammalian cell lines are chosen for their post translational modification (PTM) ability, which makes produce proteins more effective and having fewer side effects. Genetically engineered cell lines used in the production have popu-lation heterogeneity in their growth rate, protein production yield and the protein’s glycan profile, even though the population is originated from a single parental cell. This heterogeneity presents a barrier to the enhancement of protein yield and protein’s quality. Due to the continuously increasing demand for recombinant products such as monoclonal antibodies, specific productivity still needs to be optimized. And the the-rapeutic efficacy and in vivo biological function of a glycoprotein is significantly af-fected by its glycosylation profile. For the development of glycoproteins with thera-peutic applications, selection of cell lines producing a glycoprotein with adequate glycoform is crucial.
Here we demonstrate an array-based analysis of secreted proteins for rapid and effi-cient selection of a single cell producing an antibody with high productivity and a glycoprotein with desirable glycosylation. Our approach relies on microengraving and interrogation of therapeutic proteins produced by individual cells in a microwell array in terms of glycosylation profile as well as the produced amount. Based on statistical analysis of the interrogation, corresponding single cell is selected, retrieved, and ex-panded. We applied the approach to human immunoglobulin G (hIgG) for selection of high productive cells. And we also applied to human recombinant erythropoietin (rhEPO)-producing CHO cells for selection of a single CHO cell that produces rhEPO with a high sialylation degree. This method can find widespread use in the clonal se-lection for the production of other therapeutic proteins with specific glycosylation as well as high productivity in cell populations in a high-throughput manner.
최근 의약품 분야에서 생물약제의 비중이 크게 증가하는 추세이며, 생물약제 중에서도 특히 재조합 치료용 단백질들이 중요한 부분을 차지하고 있다. 재조합 치료용 단백질을 생산하기 위한 다양한 발현시스템이 존재하지만, 당화반응 등의 단백질 수식화 과정이 가장 인간과 가까운 형태로 형성된 단백질을 생산하기 위하여 동물세포 발현시스템이 선호되고 있다. 그러나 단일 동물세포에서 유래한 개체군이라고 하여도, 반복적인 세포 분열과정을 거치면서 개체군 내에 존재하는 단일 세포들의 생산성 및 당사슬의 다양성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이러한 다양성의 증가는 생산성 증대 및 치료용 단백질의 품질을 향상시키는 데 방해물로 작용하게 된다. 따라서 선별 과정을 통해 원하는 특성을 갖는 치료용 단백질을 생산하는 세포주를 빠르고 효과적으로 선별하여 향상된 특성을 갖는 새로운 세포주를 확립할 수 있는 새로운 선별방법의 개발이 중요하다.
따라서 본 연구에서는 먼저 마이크로웰 어레이(microwell array)와 형광표지된 항체를 이용하여 마이크로웰 안에 격리된 단일세포에서 생산되는 치료용 단백질의 생산량을 분석하고, 이를 바탕으로 높은 생산성을 갖는 단일 세포를 선별하여 새로운 세포주로 확립하는 방법을 개발하였다. 본 선별방법을 항체를 생산하는 CHO 세포를 선별하는 과정에 적용함으로써, 모세포주보다 높은 항체 생산성을 갖는 새로운 세포주를 확립하는 방법을 소개하였다.
또한 단백질의 생산량 및 당사슬을 동시에 분석하기 위하여, 당사슬과 특이적으로 결합하는 형광표지된 렉틴 단백질을 접목한 이중탐침(dual probing) 방법을 개발하여 소개하였다. 이중탐침 방법을 개발함으로써, 기존의 선별과정에서 당단백질의 당사슬을 분석하기 위하여 추가적으로 수행해야만 했던 복잡한 분석과정 없이 단일세포에서 생산된 당단백질의 당사슬을 분석하는 것이 가능해졌다. 특히 치료용 당단백질에서 당사슬 말단에 존재하는 시알산 함량이 증가할수록 당단백질의 생체 내 반감기가 길어져서 약효가 증가하는 특성이 알려져 있으므로, 시알산 함량이 높은 당단백질을 생산하는 세포주를 확립하는 것은 매우 중요하다. 따라서 이중탐침 방법을 접목한 본 선별방법을 시알산 함량이 높은 rhEPO를 생산하는 CHO 세포를 선별하는 과정에 적용함으로써, 모세포주보다 높은 시알산 함량을 갖는 rhEPO를 생산하는 세포를 선별하여 새로운 세포주로 확립하였다.
본 선별 방법은 기존의 방법들에 비해 한 번에 많은 세포들의 분석이 가능하여 빠른 시간 내에 효율적으로 원하는 특성을 갖는 세포들만을 선택적으로 선별할 수 있으므로, 시간과 노동력의 소모가 크게 줄어든다. 또한 항체, 호르몬, 성장인자들을 포함한 광범위한 치료용 단백질에 적용이 가능하므로, 향후 다양한 치료용 단백질을 생산하는 세포주의 개발 과정에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
