This thesis presents an isomagnetophoresis-based immunoassay system which analyzes the infinitesimal analytes with high accuracy and resolution and adjusts the dynamic ranges of target analytes. Isomagnetophoresis is an improved magnetophoresis which discriminates materials with subtle magnetic susceptibility difference. Because the magnetophoretic mobility of a particle is in proportion to the magnetic susceptibility difference between a particle and surrounding solution, a particle migrates and stays at the position where the magnetic susceptibility of a particle and the surrounding solution are equal under the magnetic susceptibility gradient of the surrounding solution (gadolinium paramagnetic diethylenetriamine-pentaacetic acid, Gd-DTPA).
For the isomagnetophoresis-based immunoassay, a new quantitative analysis method was first proposed using a magnetophoresis-based immunoassay. The quantitative analysis of proteins was conducted by measuring the position of microbeads in the microchannel. Three types of colored microbeads reacted with the respective analytes and superparamagnetic nanoparticles were focused to the opposite side from external magnetic field. They were then deflected from their focused streamlines in a microchannel as much as analytes and SMNPs are conjugated with them. Consequently, the position of each colored microbeads can be correlated with the concentration of each analytes and the detection limits of three analytes are femto-molar level.
With this new quantitative analysis method, an isomagnetophoretic immunoassay system has been developed. Here, rabbit IgG-biotin was analyzed as a model and the quantitative analysis was carried out by measuring the positions of microbeads in the outlet of a microfluidic device. To generate a magnetic susceptibility gradient, 10 mM Gd-DTPA and DI water were used. This new isomagnetophoretic immunoassay system could analyze the rabbit IgG-biotins from 19.8 aM to 266.4 fM, and showed the very low coefficient variance as 1.29%. Also, this isomagnetophoretic immunoassay system could adjust the dynamic ranges by altering the magnetic susceptibility gradient. When 100, 75, 50, and 25 mM Gd-DTPA solution were substituted for the 10 mM solution, the dynamic ranges were adjusted in the concentration ranges from 66.6 to 932.4 fM according to the concentration of Gd-DTPA solution. Similarly, the selected concentrations of target analytes in detail by tuning the dynamic ranges could be analyzed. Isomagnetophoretic immunoassay system more closely analyzed 133.2 to 466.2 fM of target analytes using 20 mM and 30 mM Gd-DTPA solution and 466.2 to 799.2 fM of rabbit IgG-biotin by the higher magnetic susceptibility gradient using 80 mM and 90 mM Gd-DTPA solution. The different dynamic ranges produced by combining Gd-DTPA solutions of different concentrations show that the immunoassay system can be adjusted for analyzing a narrower concentration range of interest with better resolution.
Using the isomagnetophoretic immunoassay system confirmed by rabbit IgG-biotin, breast cancer markers such as estrogen receptor α (ERα), progesterone receptor (PR) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) were assayed and its performance was compared with the conventional method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The magnetic susceptibility gradient was generated by deionized water and 25 mM Gd-DTPA solution to make the dynamic ranges similar with that of commercialized ELISA kit. The dynamic ranges of ERα and HER2 were from 100 pg/mL to 10 ng/mL and that of PR was from 400 pg/mL to 10 ng/mL. These dynamic ranges are comparable with the conventional ELISA kit and can be shifted to the lower concentration ranges by adjusting the concentration of Gd-DTPA solution for the magnetic susceptibility gradient. The detection limits of three breast cancer markers were determined to be 196.9 pg/mL for ERα, 201.9 pg/mL for PR and 84.7 pg/mL for HER2, respectively. These sensitivities are sufficient to distinguish the ER-positive/ER-negative, PR-positive/PR-negative and HER2 overexpression for clinical purposes. To confirm this point, isomagnetophoretic immunoassays for the quantitative analysis of ERα, PR and HER2 in MCF-7 and SK-BR-3 breast cancer cells were conducted using cell lysates and were comparable with ELISA. From both ELISA and isomagnetophoretic immunoassays, MCF-7 and SK-BR-3 cells turned out to be ER/PR positive and HER2 overexpressed cells, respectively.
본 학위논문에서는 처음으로 등자기영동기술을 면역분석법(immunoassay)에 적용하여 성공적으로 단백질 정량분석을 수행하였고, 기존의 자기영동 (magnetophoresis)이나 상용화된 방법들 (e.g., ELISA)에 비해 보다 높은 감도와 정확성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 등자기영동기술의 장점을 살려 측정하고자 하는 단백질의 농도범위에 따라 자유자재로 검출농도범위를 조정할 수 있었다. 등자기영동기술은 기존의 자기영동에서는 분리할 수 없었던 미세한 자화율 차이를 보이는 입자들을 별도의 라벨링 (labeling)없이 분리해내는 향상된 자기영동기술이다. 한 입자가 외부 자기장하에 노출되어 받게되는 자기력은 그 입자와 주변 환경의 자화율 차이에 비례하게 되는데, 주변 환경이 자화율 구배를 가지도록 형성되면, 그 입자는 주변 환경과의 자화율 차이만큼 힘을 받아 외부 자기장으로부터 밀려나거나 끌려가는 힘을 받게되고, 결국 자기 자화율과 같은 자화율을 가지는 환경에 도달해 더 이상 힘을 받지 못해 그 자리에 머물게 되는데, 이 원리를 기반으로 등자기영동기술은 미세한 자화율 차이를 가지는 입자들을 분리하게 된다. 본 연구에서는 주변 환경의 자화율 구배 형성을 위해 Gd-DTPA (gadolinium paramagnetic diethylenetriamine-pentaacetic acid)를 사용하였다. Gd-DTPA는 MRI 조영제로 사용되고 있는 물질로써 생체친화적인 성질을 가지고 있어 면역반응분석과 같은 생체시료를 사용함에 있어 특이성이 없다는 것을 확인하였다.
우선, 등자기영동기반의 면역반응분석법에 적용하기 위한 새로운 방식의 정량분석방법을 자기영동기반의 면역반응분석법을 통해 제안하였다. 본 실험에서는 3가지 색상의 6 μm 컬러비드를 이용하여 각각 rabbit IgG-biotin, mouse IgG-biotin, goat IgG-biotin을 동시에 정량분석하였다. 각각의 마이크로비드에 분석하고자 하는 단백질과 반응하는 항단백질들을 고정시키고 분석하고자 하는 각 단백질들과 반응시킨 후 최종적으로 streptavidin이 고정되어 있는 나노자성체를 결합시켜, 마이크로채널내에서 외부 자기장의 반대편으로 포커싱하면서 마이크로비드 복합체를 주입하였다. 주입된 각 입자들은 결합된 나노자성체의 농도에 따라 각기 이동하는 정도가 다르게 되는데, 이 현상을 이용해 마지막 출구부근에서 입자의 위치를 측정함으로써 단백질 정량분석을 성공적으로 수행하였다. 새로운 정량분석 방식을 이용해 본 실험에서는 펨토몰 (Femto-mole) 수준까지 단백질을 감지할 수 있었고, 등자기영동기반의 면역반응분석법에 적용될 정량분석 방식의 가능성과 정확성을 검증하였다.
이 새로운 단백질 정량분석 방식을 기반으로 하여 등자기영동기술을 단백질 면역반응분석법에 적용하였다. 본 실험에서는 rabbit IgG-biotin을 분석단백질로 선정하였고, 정량분석은 마이크로채널의 출구 부근에서 10 μm 크기의 마이크로입자 위치를 측정함으로써 이루어졌다. 등자기영동기술이 적용될 환경을 조성하고 낮은 농도의 단백질 검출을 위해 10 mM Gd-DTPA 용액과 물을 이용하여 마이크로채널내에 자화율 구배를 형성하였다. 이렇게 준비된 등자기영동기반의 면역반응분석 시스템은 19.8 aM의 감도를 보였고 266.4 fM까지 분석이 가능하였으며, 1.29%의 매우 낮은 변동계수값 (coefficient of variance)을 보였다. 또한, 이 시스템은 자화율 구배를 변경해줌으로써 단백질의 측정농도범위를 조정할 수 있었다. 들어가는 용액에 있어서 물은 고정시키고, 10 mM Gd-DTPA 용액을 100 mM, 75 mM, 50 mM, 25 mM의 Gd-DTPA 용액으로 바꿔줌으로써 각각 자화율 구배를 변경하여 형성시킨 경우, 66.6 fM에서 932.4 fM까지 넓은 범위의 단백질 농도를 분석할 수 있었다. 이와 비슷하게 본 시스템을 이용하여 분석하고자 하는 특정 범위의 단백질에 대해 보다 자세한 분석도 가능하였다. 첫 번째로 주입하는 용액을 물과 10 mM Gd-DTPA 용액 대신 20 mM과 30 mM의 Gd-DTPA 용액으로 대체하여 자화율 구배를 형성시킨 경우에는 133.2 fM부터 466.2 fM까지 더 높은 해상도 (resolution)를 가지면서 정확하게 분석할 수 있었고, 두 번째로 80 mM과 90 mM의 Gd-DTPA 용액을 이용한 경우는 466.2 fM에서 799.2 fM까지의 농도범위에 대해 물과 10 mM Gd-DTPA 용액을 사용한 경우보다 더 자세한 분석이 가능하였다. 이는 등자기영동기술의 장점을 살린 결과로 추후에 질병 진단방식으로 사용될 시 환자의 상태에 따라 유연한 분석이 가능하다는 가변성을 제시한 것이다.
이러한 결과를 토대로 본 학위연구에서는 최종연구목표로써 등자기영동기반의 면역반응분석 시스템이 실제 질병진단에 적용될 수 있는지를 검증하였고, 그 대상으로 유방암 진단을 선택하였다. 이를 위해 우선, 유방암 세포주 (Cell line)에 발현되어 있는 estrogen receptor α (ERα), progesterone receptor (PR), human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)와 같은 유방암 마커들을 검출하도록 실험을 수행하였고, 그 결과를 상용화된 ELISA 키트와 비교하여 정확성과 감도를 비교하였다. 본 시스템에 의해 도출된 결과를 ELISA 키트와 비교하기 위해 두 방법의 측정농도범위를 비슷하게 맞추었고, 이를 위해 물과 25 mM의 Gd-DTPA 용액을 이용하여 자화율 구배를 형성시켜 주었다. 이렇게 설정된 등자기영동기반의 면역반응분석 시스템은 ERα와 HER2 유방암 마커에 대해서는 100 pg/mL에서 10 ng/mL까지 측정농도범위를 보인 반면, PR 유방암 마커의 경우에는 400 pg/mL에서 10 ng/mL까지의 측정농도범위를 가졌다. 이 측정농도범위는 상용화된 ELISA 키트의 범위와 비슷한 것이고, 더 낮은 농도 또는 더 높은 농도의 유방암 마커를 검출하기 위해서는 앞선 실험과 마찬가지로 Gd-DTPA 용액의 농도를 변경함으로써 본 시스템의 측정농도범위를 조절할 수 있다. 현재 시스템의 유방암 마커에 대한 측정 감도는 ERα, PR, HER2의 각각에 대해 196.9 pg/mL, 201.9 pg/mL, 84.7 pg/mL 인 것으로 분석되었다.
실제 유방암 진단을 위해서는 진단에 사용되는 유방암 조직의 전체적인 단백질에 비해 유방암 마커로 사용되는 단백질이 얼마나 발현되었는지의 비율을 분석하는 것이 중요하다. 본 시스템의 측정 감도는 유방암 진단에 사용되는 ER-양성/ER-음성, PR-양성/PR-음성, HER2의 과다발현 등을 판단하기에 충분하였고, MCF-7과 SK-BR-3 유방암 셀을 이용하여 BCA 분석으로 측정에 사용된 셀 전체 단백질의 양을 측정하고, 등자기영동기반의 면역반응분석 시스템과 ELISA키트를 이용해 각각의 유방암 마커를 검출해 그 비율을 분석하고 두 방법간의 결과를 비교하였다. 두 방법을 이용한 분석 결과, MCF-7 셀은 ER-양성/PR-양성으로, SK-BR-3 셀은 HER2 과다발현으로 분석되어져 두 분석방법간의 일치를 보였을 뿐만 아니라 각각의 유방암 마커의 농도 또한 비슷한 값으로 측정되어, 본 연구를 통해 개발된 등자기영동기반의 면역반응분석 시스템이 유방암 진단에 적용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 더 나아가 본 시스템에 의해 측정된 값의 오차가 상용화된 ELISA 키트에 비해 더 낮은 것으로 분석되어 정확도 면에 있어서 향상되었다는 것을 증명하였다. 따라서, 본 시스템은 유방암 진단과 같은 실제 질병 진단에 적용될 수 있을 것으로 판단되고, 등자기영동기술의 장점을 살려 환자의 질병 진행상황에 맞게 환자맞춤형 진단이 가능할 것으로 사료된다.
