The biomedical applications using the atmospheric pressure plasma(APP) came into widespread in recent years. The APP has been appliedto many different kinds of cells (from prokaryotic to eukaryoticcells) and come up with interesting results. Yet, those studies tendto incline toward the application outcomes and pay less attention tothe underlying physical, chemical, or biochemical mechanisms of theplasma which induced the cellular changes. Needless to say, not onlythe plasma but also the cells have complicated systems, and thus,there are many issues to be addressed for the effective utilizationof the APP as the biomedical application tools.
In this thesis, starting from understanding the APP`s of the radiofrequency (RF) large area and the low frequency (LF) micro-jet,optimal plasma conditions for the bio-applications were found, andthen the cellular changes induced by the plasma were investigated byadopting both prokaryotic, $\textit{E. coli}$ and eukaryotic humancells as bio-targets. The 13.56 MHz RF and the 50 kHz LF plasmaswere produced in the ambient air using helium gas. The role of theplasma including heat, UV photon, and radicals induced by the plasmawas investigated in the $\textit{E. coli}$ inactivation, and theimportance of the oxygen radicals was revealed. After a comparativestudy, it was found that both LF and RF plasmas have their ownmerits and drawbacks for treating bio-medical targets. For instancethe LF plasma exhibited some merits such as lower gas temperatureand easier accessibility to the target with its longer plasmalength.
Based on the preliminary study, the LF plasma was applied to theeukaryotic cells of THLE-2 and human dermal fibroblast. A directcontact with the LF plasma, generated at the applied electrodevoltage of 1200 V for only 2 minutes resulted in various phenotypicintracellular changes which in turn induced the cell death anddetachment from the substrate. Using the immunofluorescence assay,the necrotized cells were observed to undergo severe cytoskeletaldisruptions except the non-electrically assembled intermediatefilaments. In addition, the cells treated by the plasma at lowerelectrode voltage ($<~$1000 V) avoiding direct contact for a longertreatment time (10 - 20 min) experienced long term cellular changesof apoptosis and morphology or motility alteration within (24 - 48hours). The following immunofluorescence analysis showed that theincrease of the driving power frequency from 20 kHz to 80 kHzenhanced those cellular morphology changes. Throughout theexperiments, the cells were treated with the plasmas under variousdischarge conditions, and it was inferred that the different plasmaconditions induced different cellular changes for both short andlong terms by means of reactive oxygen radicals or charged particlesin the plasma.
The next study was aimed at assessing the APP ability as a cancertherapeutic biomedical tool. The APP was applied to human liverSK-HEP-1 and mammary gland epithelial MDA-MB-231 cacner cells. Thecancer cells were detached more easily than the normal cells for thesame plasma treatment, suggesting the selective cancer cell removalpossibility. For example, SK-HEP-1 cells were detached from theextracellular matrix (ECM) substrate at the input voltage of 950 V,while the normal THLE-2 cells remained intact. Similarly,MBA-MD-231 cells were detached at the input voltage of 1000 V, whilethe normal MCF-10A cells were still attached even at the higherinput voltage of 1200 V. This differential cellular behavior of thecancer and the normal cells to the plasma were attributed fromdifferent intrinsic characteristics of the cells such as maturity offocal adhesion, protein complexes through which the cytoskeleton ofa cell connects to the extracellular matrix. These selectivedetachment characteristics of the cancer cells from the normal cellsunder the same discharge condition suggest its high potential as amedical therapeutic tool.
Various cells were treated by the APP, and cellular changes wereprovoked due to the APP`s highly active chemical species andelectrically charged particles. These changes were differentdepending on the discharge conditions controlled by many operatingparameters including input voltage, driving frequency, supply gasand flow rate, and treatment time. Thus, enhancing the APPcontrollability would be an important research issue for successfulbiomedical application of APP.
대기압 플라즈마는 최근 몇 년간 세포 및 조직, 생체 등에 다양하게적용되어 그 생물, 의학적 응용 연구가 활발하게 수행되고 있다. 현재는대기압 플라즈마의 다양한 화학적 활성종이 생물 응용에 중요한 요소로판단되고 있다. 그러나 응용에 대한 높은 관심에 비해 지금까지 대부분연구는 플라즈마가 세포 등에 유도하는 현상에 대한 생물학, 의학적이해를 배제한 채 현상적 관찰에 국한되고 있는 경향이 있다. 따라서 본연구에서는 플라즈마 및 세포에 대한 물리, 생물학적 지식과 도구를이용하여 플라즈마가 세포에 미치는 영향과 그 원리 등에 대하여 심도있는 이해를 시도하였다.
세포 실험에 앞서 RF 대면적 플라즈마, LF 마이크로 제트 플라즈마의생물 응용 적합성을 판단하기 위하여 플라즈마 기체온도를 비롯한 각종전기, 광학적 특성을 조사하였으며 이를 바탕으로 생물 시료에 안전한플라즈마 방전조건을 찾았다. 다음으로 두 RF 대면적 플라즈마와 LF마이크로 제트 플라즈마를 이용하여 원핵 세포군의 한 종류인 대장균세포의 비활성화 실험을 수행하였다. RF 플라즈마 실험에서 기체온도가50 $^{o}$C 이하인 70 W 이하의 인가전력 범위 내에서 실험을 진행하여플라즈마가 시료에 인가하는 열적 효과를 배제하였으며 플라즈마에서방출되는 자외선으로 동일 비활성화 실험을 반복하여 자외선 효과가미미함을 증명하였다. 그리고 플라즈마 내의 산소 활성종이 세포의비활성화에 주도적인 역할을 함을 밝혔다. 또한 마이크로 제트 플라즈마구조에서는 LF 및 RF 플라즈마 비교 실험 결과를 바탕으로 긴 플라즈마길이(수 cm), 낮은 기체온도(상온)를 갖는 LF 플라즈마가 인체 세포응용에 더 적합하다고 판단하였다.
선행 연구를 바탕으로 LF 플라즈마를 선택하여 인체세포에 적용하였으며,인체세포로는 상피세포 종류인 THLE-2와 간엽세포 종류인 Human dermalfibroblast 세포를 사용하였다. 본 세포들은 인체 처리 시 플라즈마가가장 직접적인 영향을 줄 수 있는 조직 세포들이다. 플라즈마 처리조건은크게 두가지로 나뉘었다. 먼저 세포가 플라즈마에 직접 닿으며상대적으로 높은 인가전압($>$ 1000 V)에서 2분 동안 짧게 처리한 조건,그리고 플라즈마가 세포에 직접 닿지 않고 상대적으로 낮은 인가전압($<$ 1000 V)에서 긴 시간(10 - 20 분) 동안 처리 한 조건이다. 먼저전자의 조건에서 플라즈마와 직접 접촉하여 괴사된 세포들을 형광이미징을 통해 관찰한 결과, 세포의 골격구조(cytoskeleton) 및국소접착부위(focal adhesion)가 파괴되었음을 확인하였다. 다음으로 970V에서 발생된 플라즈마로 세포를 간접적으로 처리한 후 24 - 48 시간동안 추가 배양한 세포의 거동을 관찰하였다. 그 결과 세포의 운동성과모양이 변했으며 플라즈마가 물리적 비접촉 조건에서도 장기적인 세포변화를 초래할 수 있음을 밝혔다.
마지막으로 암 치료 도구로서의 플라즈마의 가능성을 확인하기 위하여플라즈마를 간암(SK-HEP-1) 및 유선암(MDA-MB-231) 세포에 적용하였다. 대기압 플라즈마의 의학적 활용 가능성을 높이기 위해 중요한 점은 정상세포에는 영향을 주지 않는 같은 조건에서 암 세포의 선택적 파괴가이루어져야 한다는 것이다. 이를 위하여 동일한 플라즈마 조건에서 정상및 암 세포를 처리하였다. 전극인가전압을 950 V에서 1200 V로변화시켜가며 정상 세포는 거의 영향을 받지 않고 암세포만세포외기질(Extracellular matrix, ECM)에서 떨어지는 플라즈마 조건을찾았다(간세포: 950 V, 유선세포: 1000 V). 두 세포의 이런 차이는 ECM과세포를 연결해주는 focal adhesion이 정상 세포에 약 2.5배 이상 많으며동시에 더 크고 견고한 세포의 고유 특성에서 비롯되었음을 형광이미징방법을 통해 알아내었다.
본 연구에서는 다양한 세포들에 대해 플라즈마가 유도하는 세포 변화를관찰하였다. 다른 조직에서 비롯된 세포는 실제 응용 시 같은플라즈마에도 다르게 노출된다는 점을 고려하여 세포에 따라서 플라즈마방전 조건(전극인가전압(100 V - 1200 V), 인가 주파수(20 kHz - 80 kHz,13.56 MHz), 기체조성(헬륨 및 산소) 등)을 변화시키며 실험을진행하였으며, 그 결과 방전 조건에 따라서 세포의 생존, 구조, 거동등이 달라짐을 확인하였다. 이런 세포 변화는 실험 결과 플라즈마내의산소활성종 등의 화학적 활성종이나 대전입자들에 의한 것으로 판단되며,이것은 플라즈마의 효과적인 응용을 위해서는 결국 플라즈마 제어를 통한활성종 밀도 등의 최적화가 중요함을 의미한다. 또한 플라즈마가암세포의 자살을 유도하는 기존 연구를 바탕으로 암세포와 정상세포를동일한 조건에서 처리하여 암세포만 선택적으로 괴사시킬 수 있는조건($\leq$ 1000 V)을 찾았다. 이러한 결과를 바탕으로 향후에플라즈마를 의학 치료목적으로 사용하기 위해서는 세포의 변화 등에 대한생물학적인 분석 및 해석이 더 진행되어야 할 것이다. 또한 세포단위에서더 나아가 세포층 사이의 상호작용이 존재하는 조직의 단위에서의플라즈마의 역할을 밝혀야 할 것이다.
