Recent development of microscopy technique, its related technique, and the fluorescence spectroscopy enables to produce the results about biomolecules, namely nuclear acids, proteins and lipids. Theoretical tools to analyze the result from experiment and to design the experiment are getting improved since the number of parameters which need to be concerned increases as the complexity of equipments.
In this paper, the ‘model speculation’ scheme is defined and applied to the experimental results from fluorescence resonance energy transfer (FRET) which can monitor the reaction of biomolecules and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) which measures the diffusion of biomolecules.
‘Model speculation’ scheme is defined as the method which enables to choose correct model before we try to find the proper fitting curve. Here the scheme is made of the model free method (maximum entropy method) and the transformation method.
The bulk FRET measurement is performed to observe the reaction between the complement pair of short DNA fragments. The reaction kinetics cannot be decomposed mathematically into the first order reaction kinetics even with the hard sphere collision assumption. The maximum entropy method (MEM) is applied to decompose the kinetics, and the results show the two component first kinetics. This result is confirmed by the nonlinear fitting with the model of two exponentials. It is conjectured that the existence of transient variant form makes the occurrence of one component, and the simple approaching of two strands is for another one.
To monitor the diffusion of proteins, the FCS is used, which gives the autocorrelation of intensity fluctuation as a result. The autocorrelation curve contains the information of diffusion time and the mean number of particles inside the confocal volume. In crowded media or in a cell, the diffusion of protein can be normal diffusion, or anomalous diffusion, or mixture of several diffusion components. To interpret the resulted value from model fitting, the proper choice of fitting model is necessary. Since usually autocorrelation curve fitting is optimized around the diffusion time point, model speculation method rather than model fitting method can find the plausible model efficiently and accurately. In this paper, the computer simulation of diffusion in crowded media and FCS, the recombinant eGFP diffusion in the presence of high concentration of crowding agents, and the eGFP diffusion in cell organelles, such as plasma membrane, endoplasmic reticulum, and cytoplasm are performed and the model speculation scheme is tested on each cases. The results imply that the spatial correlation activate the anomalous diffusion in crowded media, that the transient anomalous diffusion which is not analytically formulated can be emerged in the regime between the two component of normal diffusion, and that in the cell component, the two component diffusion can generate the transient anomalous diffusion which can be explained by the compartmentalized model.
Model speculation scheme is successfully applied to the reaction and diffusion of biomolecules and it can offer an aid to build the proper model.
최근 현미경 기술의 발전과 그와 관련된 측정 기기 및 형광 분광학의 발전으로 생분자(biomolecule), 즉 핵산류, 단백질류, 지질류 등에 대한 실험 결과들이 쏟아져나오고 있다. 점점 한 실험에 사용되는 광학기기의 복잡도가 증가하면서 실험설계시 고려해야 할 변수가 많아지고, 생분자의 특성상 복잡한 환경변수의 영향을 받기 때문에 실험설계부터 실험결과의 해석까지 필요한 이론적 도구 역시 함께 발전하고 있는 상황이다.
본 논문에서는 그러한 실험들 중 생분자의 반응을 확인할 수 있는 FRET 현상을 이용한 반응실험과 생분자의 확산을 관찰하기 위한 형광상관분광학(Fluorescence Correlation Spectroscopy)를 이용한 생분자의 확산 동역학 실험을 수행하고 그 결과를 본 논문의 제목인 ‘모형 추정하기’ 틀에 맞추어 분석하였다.
‘모형 추정하기’ 틀은 어떤 모형을 정하고 정확한 매개변수 및 계수들의 값을 추정하기 이전에 적절한 모형을 찾기 위한 작업에 관한 것이다. 그 틀은 최대엔트로피방법을 이용한 무-모형방법과 원래 얻어진 결과값을 적절한 수학적 변환을 통해서 모형을 추정하는 방식으로 이루어져있다. 짧은 DNA 조각들의 반응에 관한 FRET 실험을 통하여 수학적으로 일차반응으로 분해가능하지 않은 경우에도 몇가지 다른 특성시간을 갖는 일차반응들로 그 반응을 이해할 수 있다는 것을 확인하였다. 이를 확인하기 위해 상보적으로 결합하는 두 개의 짧은 DNA 조각들을 사용하여 이들의 FRET 신호를 관찰하였다. 그 결과는 최대엔트로피방법을 사용하여 분석되었고 비선형 곡선 추정 방법을 통해 두 개의 일차반응으로 이 현상을 이해할 수 있음을 알게 되었다. 이 경우 DNA 조각들이 형성하는 다른 상황들도 모형추정틀을 이용하여 확인할 수 있다는 것을 알 수 있다.
형광상관분광학을 통해 얻어지는 결과는 자기상관(Autocorrelation)곡선인데, 이 곡선을 이론적으로 유도한 적절한 모형에 맞추어보아 분자의 확산계수를 구하는 방법이다. 그러나 분자의 확산은 정상확산(normal diffusion) 뿐 아니라 이상확산(anomalous diffusion) 역시 나타날 수 있고, 서로다른 확산계수를 갖는 분자들이 함께 섞여있는 경우도 있을 수 있다. 결국 우리가 잘 알지 못하는 현상에 접근할 때는 모형을 결정하는 것이 최종결과 및 해석에 큰 영향을 끼칠 수 있는 것이다. 그래서 모형 선택 이전에 모형추정틀을 이용하여 모형선택을 더욱 적절한 방식으로 하게 하였다. 시험 대상은 컴퓨터를 이용한 공간적으로 상관되어있지 않은 밀도가 높은 구역에서의 긴 뜀거리 확산 결과, 높은 밀도의 환경에서의 eGFP의 확산 실험 결과, 그리고 세포의 각 구역, 세포막/ER/세포내부 등의 공간에서의 eGFP 확산 실험 결과 등에 대해 적용되었다.
실험결과 공간적 상관성이 결국 이상확산을 초래한다는 것을 알 수 있었고, 전역이상확산(global anomalous diffusion)이 아닌 일시적 이상확산 (transient anomalous diffusion)의 경우 두 요소 확산 (two component diffusion)의 사이 구간에서 나타남을 확인할 수 있었다. 특히 세포내 실험의 경우 두 요소 확산 결과가 알려진 이래 이상확산을 하는 것인지 두 요소 확산으로 파악되는 정상확산을 하는 것인지에 대한 이견이 존재해왔다. 본 논문의 결과로는 우리가 알고 있는 일시적 이상확산은 두 요소 확산의 각 요소 사이에 존재하는 경우로, 구획모형(compartmentalized model)이 그것을 설명하는 하나의 방법이 될 수 있을 것이라 추정한다.
이처럼 모형추정틀은 큰 어려움 없이 원결과(raw data)의 특성을 사전지식없이도 판단할 수 있다는 것을 보여준다.
