PA4608 is a single PilZ domain protein from $\emph{Pseudomonas aeruginosa}$ that binds to cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP). While the monomeric structure of unbound PA4608 has been studied in detail, the molecular details of c-di-GMP binding to this protein are still uncharacterized. Hence, we determined the solution structure of c-di-GMP bound PA4608. We found that PA4608 undergoes conformational changes to expose the c-di-GMP binding site by ejection of the C-terminal $3_10$ helix. An increase in flexibility of the C-terminal tail in the presence of c-di-GMP implies that this region acts as a lid that alternately covers and exposes the hydrophobic surface of the binding site. In addition, mutagenesis and NOE data for PA4608 revealed that conserved residues are in contact with the c-di-GMP. The unique structural characteristics of PA4608, including its monomeric state and its ligand binding characteristics, yield insight into its function as a c-di-GMP receptor.
Ribonuclease P is an enzyme which releases the 5’-precursor sequence from immature tRNAs and produces mature tRNAs. RNase P consists of a catalytic RNA subunit and a cofactor protein subunit, and especially for $\emph{ Escherichia coli}$, RNase P is composed of M1 RNA and C5 protein. Although \emph{in vitro} data shows that M1 RNA has catalytic activity at high concentration of magnesium ion without the C5 protein, $\emph{in vivo}$ data indicate that C5 protein is essential and seems to affect the catalytic activity of RNase P. RNase P is categorized to two type - A-type(Ancestral type) and B-type (Bacilus type) - depending on RNA shape. Although the secondary structure of A-type RNase P RNA is different to that of B-type, RNase P protein of A-type and B-type is believed to have similar tertiary structure. The accurate function of the C5 protein in vivo is unknown, but three dimensional structure of C5 protein could help to understand the structural and functional role of C5 protein. In this study, the solution structure of C5 protein was determined by NMR spectroscopy. C5 protein is consists of four-stranded $\beta$-sheet and three helices. C5 protein has two suspected RNA binding sites. One candidate is consisted of unusual left-handed $\beta-\alpha-\beta$ crossover including RNR-motif that is highly conserved through RNase P protein family. The other is central cleft which is consisted of four $\beta$-strand and one $\alpha$-helix, which is differently conserved depending on A- and B-type. The sequence alignment and structure of C5 protein are able to support previous biochemistry experiment data and explains the difference precursor transfer RNA recognition in $\emph{E.coil}$ and $\emph{B.subtilis}$. The knowledge of the C5 protein structure will help us to understand the substrate recognition mechanism of RNase P.
PA4608은 P.aeruginosa의 single PilZ domain으로 c-di-GMP와 결합한다. c-di-GMP가 없는 PA4608만의 구조는 이미 밝혀졌지만, 아직까지 c-di-GMP와 결합하였을 때의 구조적인 변화에 대해서는 알려져 있는 바가 없다. 우리는 c-di-GMP가 결합했을 때의 PA4608의 구조를 구하였다. PA4608은 anti-parallel $\beta$-barrel과 긴 $\alpha$-helix, 1개의 $3_10$ helix로 이루어져 있다. 구조로부터 c-di-GMP이 $3_10$ helix로 가려진 binding site에 결합한다는 것을 알 수 있다. 또한 C터미널의 $3_10$ helix가 c-di-GMP와의 결합에 의해 자유도가 높아지는 것으로부터 $3_10$ helix가 c-di-GMP의 binding site를 가려주는 뚜껑의 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 추가적으로 다른 PA4608의 mutagenesis와 NOE 데이터로부터 PilZ domain에 보존되어있는 residue들이 c-di-GMP 결합에 직접적으로 관여한다는 것을 알 수 있다. 우리는 구조와 NMR, mutagensi 실험들로부터 얻어진 자료들로부터 C-di-GMP와의 결합으로 인해 유도되는 PA4608 고유의 구조적인 특징들을 밝혀내었으며, 이로부터 PilZ domain자체만으로 c-di-GMP receptor로서 작용할 수 있음을 증명하였다.
Ribonuclease P는 precursor transfer RNA의 5’-leader sequence를 절단하여 transfer RNA를 만드는 효소이다. RNase P는 효소작용을 가지는 RNA와 보조적인 단백질로 이뤄진 ribozyme으로서 E.coli의 RNaseP는 M1 RNA와 C5 protein으로 불리는 단백질을 가지고 있다. M1 RNA는 in vitro에서는 C5 protein가 없어도 효소작용을 할 수 있지만, in vivo에서는 C5 protein을 필요로 한다. RNase P는 RNA의 형태에 따라 A-type과 B-type으로 나뉘게 된다. RNase P protein은 낮은 sequence similarity에도 불구하고 A,B-type에 상관없이 높은 삼차구조 similiarity를 보인다. 지금까지 C5 protein은 높은 농도로 얻기가 어려워 구조가 구하기가 쉽지 않았으나, 우리는 ammonium sulfate precipitation방법을 이용하여 높은 농도의 native C5 protein를 얻어 NMR 구조를 구할 수 있었다. C5 protein의 구조는 4개의 베타 시트와 3개의 helix로 이루어져 있으며, 이전에 구해진 다른 species의 RNase P protein들과 전체적으로 비슷한 구조를 가지고 있다. 또한 A-,B-type에 따라 나타나는 대조되는 $\beta2$ sheet의 residue conservation차이부터 RNase P protein이 5’-leader sequence를 인식하는 메커니즘이 A,B-type에 따라 다르리라는 것을 유추해내었다.
