Biological methods for restoration suggest an improved substitute for ineffective and costly phsico.chemical remediation methods. However, only a small fraction of the total microbial ecosystem has been harnessed for this purpose. Exploring and exploiting unrevealed microbial community associated with the degradation of xenobiotics can provide insight into the development ‘Biocatalysts’ for environmental restoration. In this study, culture independent approaches such as analysis of microbial diversity and ecology, and detection of catabolic genes were used to improve the process of efficacy determination and implementation of microbial bioremediation strategies in petroleum hydrocarbon contaminated site (soil and groundwater).
For remediation of diesel contaminated soil, intrinsic biodegradation potential was estimated by analysis of microbial communities and diesel-assimilating bacteria were isolated. Comparative bioremediation showed that despite the existence of native diesel assimilating bacteria, natural attenuation and biostimulation were not effective in diesel biodegradation and enhanced biodegradation efficiencies were observed in bioaugmentation with enriched diesel-assimilating strains. From this result, bioaugmentation with an indigenous diesel assimilating bacteria (PO1, identified as $\It{Rhodococcus}$ sp.) and two exogenous strains was performed and microbial activity and community structure were monitored during bioaugmentation. It was demonstrated that the bioaugmentation enhanced degradation efficiency and the greatest degradation of TPH (total petroleum hydrocarbon) was achieved after six weeks of the experiment (55.9%). The microbial number and enzyme activity were higher in bioaugmentation than in control (natural attenuation) and the results were correlated with TPH degradation, indicating the positive influence of treatment. However, increase in total bacterial number and microbial activity did not correlated with TPH degradation. Thus, it is assumed that activating and maintaining active degrader are most important in bioremediation rather than increasing total microbial activity by biostimulation. In the analysis of microbial population and DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), both indigenous and exogenous inoculants were detected in culture-dependent analysis but only indigenous strain PO1 was observed as one of the predominant populations in DGGE profiles.
For the groundwater remediation of petroleum hydrocarbon contaminated site, MTBE (methyl tertiary butyl ether), which is the most widely used additive in gasoline, was targeted. The ecotoxicity of MTBE, effect of co-contaminants such as TBA (tert butyl alcohol) and BTEX (benzene, toluene, ethylene, xylene) on biodegradation of MTBE, and co-metabolic degradation of MTBE were investigated. The results showed that about 90% of MTBE was degraded by oxygen stimulated biodegradation. The addition of BTEX had no noticeable effect on MTBE biodegradation, whereas TBA seemed to have inhibition effect on MTBE biodegradation. Ecotoxicity assessment by real-time PCR and microbial community analysis showed appearance of bacteria which have pollutant degrading capacities and this implies that activation and maintenance of these bacteria can be promising in bioremediation of MTBE. The co-metabolic degradation of MTBE by methane showed good degradation efficiency, whereas previous studies which showed no cometabolic degradation by methane. The total bacterial number and the copy numbers of alkB and mmoX genes were increased when co-metabolic degradation was initiated by methane oxidizing bacteria. Addition of methimazole (monooxygenase inhibitor) had an adverse effect on MTBE biodegradation, indicating that degradation of MTBE was occurred by monooxygenase activity in co-metabolic degradation process. The combined application of air-sparging and cometabolism greatly enhanced MTBE biodegradation. Especially, use of microbubble system increased dissolved oxygen and inoculants distribution within reactor.
In conclusion, application of culture-independent approaches to bioremediation and biomonitoring was useful to understand parameters governing biodegradation and community structure of microbial ecosystem. The results described here suggest that site specific characterization study to predict actual activity of inoculants is needed prior to remediation of contaminated site and the interpretation and management of various data generated by analysis of microbial ecosystem have an enormous impact on the efforts to sustain a healthy and clean environment.
본 연구에서는 무배양식 기법을 이용하여 미생물의 생태계를 분석하고 오염물의 분해와 관련된 미생물과 유전자를 탐색함으로써 석유계 탄화수소 오염 현장의 생물학적 분해 효율을 높이고자 하였다. 연구는 크게 두 부분으로 나누어져 있으며 첫번째 부분에서는 디젤로 오염된 토양의 생물학적 분해를, 두번째 부분에서는 가솔린의 첨가제인 MTBE로 오염된 대수층의 정화를 위한 생물학적 분해에 관련된 연구를 수행하였다.
디젤로 오염된 토양의 정화를 위해 실험에 사용된 토양으로부터 디젤 분해 가능 미생물을 분리하였고 이를 이용하여 다양한 방법의 생물학적 복원 실험을 수행하였다. 토착 미생물과 외부 미생물을 사용한 bioaugmentation 및 모니터링 결과 외부 미생물에 비해 토착 미생물의 활성이 더 오래 유지되는 것으로 나타났으나 토착 미생물 역시 일정 시간이 지나면 그 수가 줄어드는 양상을 보여, bioaugmentation의 경우 모니터링으로 주입된 미생물의 활성을 측정하고 그 결과를 통해 주기적인 주입 시기를 결정하는 것이 중요함을 알 수 있었다.
호기성 조건 하에서 MTBE 분해 실험 결과, 산소의 추가적인 공급을 통해 약 40일 간 90% 의 MTBE 분해 효율(초기농도 300 ppm)을 얻을 수 있었다. MTBE 분해에 영향을 주는 인자를 도출하기 위해 MTBE 생분해 과정의 중간 대사 산물인 TBA와 MTBE 오염 현장에서 함께 발견되는 또 다른 오염물인 BTEX를 첨가한 실험 결과, MTBE에 비해 상대적으로 분해가 쉬운 TBA 또는 BTEX의 분해가 끝난 다음에 MTBE의 분해가 개시되었다. 그러나 BTEX의 경우 분해 속도가 매우 빨라 전체적으로는 MTBE의 분해에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이는 BTEX에 의해 MTBE 분해가 저해된다고 보고한 기존 연구 결과와 대비되는 결과로서, 본 실험에서 이용한 다양한 미생물로 인해 단일 미생물을 이용한 기존 연구의 한계를 극복할 수 있었던 것으로 보인다. 또한 methane을 이용한 cometabolism과 air-sparging을 결합하여 methane monooxygenase에 의한 분해와 산소 공급으로 인한 MTBE의 호기성 분해 효율을 높일 수 있었다. 특히 micro-size의 매우 미세한 기포를 발생시키는 ultra fine bubble 시스템을 적용하여 용존 산소량과 미생물의 산소 이용률을 높일 수 있었고, cometabolism을 위해 주입한 미생물이 반응기 전체에 고르게 분포하도록 하여 MTBE 분해 효율을 획기적으로 높일 수 있었다.
결론적으로 본 연구에서는 생물학적 복원 및 모니터링에 미생물의 분석을 위해 무배양적 기법을 적용함으로써, 오염물의 생물학적 분해와 미생물 생태계에 영향을 미치는 여러 인자들에 대해 이해할 수 있었고 이를 통해 분해 효율을 향상시킬 수 있었다. 본 연구에 적용된 미생물 생태 분석 기법은 오염 지역에 서식하는 미생물의 특성 및 생물학적 복원 효율을 예측할 수 있으며, 복원을 수행하는 중에도 모니터링 방법으로 이용함으로써 실제 복원 현장에서 매우 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
