Injectable cell therapy would provide a patient friendly procedure for treatment of degenerated or wounded tissue. Biodegradable injectable porous microspheres were fabricated to use as dual-purpose microcarriers for cell culture and injectable scaffold for tissue regeneration. Gas foaming in a water-in-oil-in-water (W/O/W) double emulsion was performed for fabricating the well-interconnected porous microcarriers using poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA). The gas foaming conditions were finely tuned to control the structural and morphological characteristics. Porous microcarriers with a mean size of ~ $175\mum$ and an average pore diameter of ~ $29\mum$ were produced for cell cultivation and injectable delivery. To promote cell seeding, amine functionalized porous microcarriers were prepared by blending amine functionalized PLGA with unreacted PLGA. To assess the porous microcarriers for chondrocyte cultivation, bovine articular chondrocytes were seeded and cultured in vitro in spinner flasks for 4 weeks. Visualization and biochemical analyses of the microcarrier-cell constructs were performed to demonstrate cell proliferation and phenotypic expression. Quantification of DNA, glycosaminoglycan, and collagen content showed that greatly enhanced cell proliferation and expression of cartilage-specific phenotype were observed for cultures in the order of amine functionalized porous microcarriers, porous microcarriers, nonporous microcarriers, and monolayer culture.
Cellular aggregates were prepared using biodegradable porous microspheres for injectable reconstruction of soft tissues $\it{in vivo}$. Biodegradable porous microspheres with sizes of ~ $50\mum$ were prepared by a porogen leaching-phase separation process in an oil-in-water single emulsion method using poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA). 3T3 L1 mouse preadipocyte cells were transformed into cellular aggregates by suspension cultivation in a spinner flask using the porous microspheres as effective buoyant and cell adhesive microcarriers. Spherically-shaped aggregates were readily formed with sizes of up to $1000\mum$ with a higher number of viable cells compared to the nonporous microspheres. The resultant cellular aggregates exhibited far better extent of differentiation into adipocytes, compared to the cell aggregates prepared from nonporous microspheres or monolayer-cultured cells. The cellular aggregates could also be injected into nude mice using a syringe needle for adipose tissue regeneration $\it{in vivo}$. Immuno-histochemical studies showed that the aggregate-derived tissues with porous microspheres displayed histological characteristics similar to adipose tissues 4 weeks after injection.
Injectable mesenchymal stem cell aggregates were formed using hyaluronic acid (HA) immobilized porous biodegradable microspheres for adipose tissue regeneration. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (AMSCs) were aggregated in a controlled manner and differentiated into adipocytes by cultivating in a stirred suspension bioreactor. The resultant cellular aggregates were ~ $1700\mum$ in diameter and exhibited fully differentiated adipocytes as shown by immuno-cytochemistry and RT-PCR. The cultured aggregates could be smoothly injected into the subcutaneous region of mice through a syringe needle due to their soft elasticity and deformability. The $\it{in vivo}$regenerated adipose tissue maintained a proper dimension and shape with showing natural adipose tissue characteristics as demonstrated by various histological staining procedures. HA immobilized microspheres significantly enhanced cell differentiation during 3D cultivation, and tissue regeneration when implanted in vivo, compared to unmodified porous microspheres. This study showed that AMSC cellular aggregates prepared by using porous microspheres could be delivered in an injectable manner into the body and could have great therapeutic potential for soft tissue augmentation and reconstruction.
조직 공학 및 재생 치료를 위한 생체재료에 관한 연구는 수십 년 전부터 활발히 이뤄져 왔다. 고분자 지지체는 세포 전달을 통한 조직 재생에 있어서 세포 점착 표면을 제공함과 동시에 손상된 조직에서 구조적인 보조 역할을 한다. 특히 주사 가능하고 생분해성을 가지는 조직 공학용 생체재료의 경우 환자친화적이고, 수술 후 조직 협착을 방지할 수 있는 장점을 지닌다.
본 연구에서는 생분해성 고분자인 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)를 이용하여 다공성 구조를 가지는 미립구를 제조하였고, 이를 세포 배양 및 주입형 조직 공학에 응용하는 실험을 수행하였다. 첫번째로는 수중유중수 이중 유화액(water-in-oil-in-water double emulsion)내에서의 기체 발포(gas foaming) 과정을 이용하여 크기가 약 200 마이크론, 공극이 약 30 마이크론이 되는 생분해성 다공성 미립담체(biodegradable porous microcarriers)를 제조하였다. 이에 더해 다공성 미립담체에 세포 점착력을 강화시키기 위해서는 표면에 아민기를 도입시켰다. 이렇게 아민기가 도입된 다공성 미립담체는 연골세포를 부착시켜 장기간 3차원 배양을 한 결과 세포 증식, 그리고 연골세포 특이적인 세포외기질(extracellular matrix) 물질 분비가 촉진되었다.
다음으로 생체 주입을 위한 시스템으로 크기가 약 50 마이크론,공극이 3 ~ 5 마이크론인 PLGA 다공성 미립구(porous microsphere)를 이용하여 세포 집합체(cellular aggregate)를 형성시켜 지방조직 재생에 응용하는 실험을 하였다. 다공성 미립구는 유중수 단일 에멀션(oil-in-water single emulsion)에서 공극원 침출-상 전이(porogen leaching-phase separation) 과정을 이용하여 제조하였다. 우선, 지방세포의 전구세포인 3T3 L1 세포를 이용하여 다공성 미립구와 함께 크기가 약 200 마이크론인 세포 집합체를 형성하도록 하고, 2주간 부유배양시 크기가 800 마이크론 정도되는 구형의 집합체가 형성되었다. 또, 부유배양과 동시에 적절한 분화 인자를 첨가하여 지방세포로 분화시켰을 때 비다공성 미립구(nonporous microsphere)에 비해 세포 생존률 및 지방세포 특이적인 유전자 발현이 촉진되었다. 그리고 분화시킨 집합체를 주사로 쥐의 피하에 주입하였을 때 다공성 미립구로 형성시킨 집합체의 경우 비다공성 미립구의 집합체나 세포 단독의 경우보다 지방조직 재생 효과가 향상되었다.
마지막으로는 PLGA 다공성 미립구를 생리활성 물질로 수식한 후 줄기세포에 적용하여 주입형 조직 재생에 이용하고자 하였다. 다공성 미립구 표면에는 히알루론산(hyaluronic acid)을 고정화하였고, 이를 이용하여 성체 줄기세포인 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)의 집합체를 형성하여 지방세포로 분화시켰다. 히알루론산이 수식된 다공성 미립구(MS-HA)의 경우 수식되지 않은 다공성 미립구에 비해 줄기세포 집합체의 분화 정도가 크게 향상되는 결과가 나타났다. 또, 분화시킨 줄기세포 집합체를 주사로 쥐의 피하에 주입하였을 때 MS-HA의 집합체의 경우 지방조직 재생이 크게 촉진되는 것이 관찰되었다.
결론적으로 다공성 미립담체와 다공성 미립구는 각각 세포의 3차원적인 배양을 위한 담체, 그리고 체내 주입을 위한 세포 집합체 형성 지지물로써 중요한 역할을 함을 확인하였다. 특히 다공성 미립구를 이용하여 형성하는 세포 집합체 시스템은 주입형 조직 재생 치료에 높은 응용 가능성을 가지므로, 앞으로 더 심층적인 연구가 진행되어야 할 것이다.
