Okazaki fragment processing is hot spot for initiation of genome instability in eukaryotes. The principal mechanism of Okazaki fragment processing is via generation of flaps, which have a potential to form a variety of structures in their sequence context. These structures are properly processed by multiple layers of redundant pathways, which network with each other in intricate ways. Here, we elucidate the role of Vts1 and Rad52 in Okazaki fragment processing.
The non-essential $\sl{VTS1}$ gene of $\sl{Saccharomyces cerevisiae}$ is highly conserved in eukaryotes and encodes a sequence- and structure-specific RNA binding protein. The Vts1 protein has been implicated in posttranscriptional regulation of a specific set of mRNAs that contains its binding site at their 3’-untranslated region. In this study, we identified $\sl{VTS1}$ as a multi-copy suppressor of $\sl{dna2-K1080E}$, a lethal mutant allele of $\sl{DNA2}$ that lacks DNA helicase activity. The suppression was allele-specific, since overexpression of Vts1 did not suppress the temperature-dependent growth defects of $\sl{dna2Δ405N}$, devoid of the N-terminal 405 amino acid residues. Purified recombinant Vts1 stimulated the endonuclease activity of wild-type Dna2, but not the endonuclease activity of Dna2Δ405N, indicating that the activation requires the N-terminal domain of Dna2. Stimulation of Dna2 endonuclease activity by Vts1 appeared to be the direct cause of suppression, since the multi-copy expression of Dna2-K1080E suppressed the lethality observed with its single-copy expression. We found that $\sl{vts1Δ dna2Δ405N}$ and $\sl{vts1Δ dna2-7 }$double mutant cells displayed synergistic growth defects, in support of a functional interaction between two genes. Our results provide both $\sl{in vivo}$ and $\sl{in vitro}$ evidence that Vts1 is involved in lagging strand synthesis by modulating the Dna2 endonuclease activity that plays an essential role in Okazaki fragment processing.
Rad52 is a key protein which is required for exchanging RPA to Rad51 to form Rad51-ssDNA filament. This filament is accessible to invade homologous sequence. We identified $\sl{RAD52}$ as a multi-copy suppressor of $\sl{dna2-K1080E}$. This suppression was not observed when introducing mutation in acidic region of Rad52. This mutant, Rad52 QDDD/AAAA, barely interacts with RPA and decreases strand exchange activity. Hence, the suppression was dependent on Rad52 activities which are required for the recombination. In addition, we observed higher recombination rate in dna2Δ405N, an N-terminal 405 amino acid deficient mutant. We also verified the increase of the recombination intermediates in dna2Δ405N by performing neutral-neutral 2-dimentional DNA agarose gel electrophoresis. The synergistic growth defect of $\sl{rad52Δ dna2Δ405N}$ suggests that homologous recombination and Okazaki fragment processing is interdependent. The $\sl{dna2-1, dna2-2, dna2-8}$ mutants showed increased level of H2A Ser129 phosphorylation which provides the possibility that the Okazaki fragment processing by recombination is double strand break (DSB)-dependent in the presence of DNA damage. Together, homologous recombination is a major redundant pathway to process Okazaki fragments.
오카자키 단편 처리 과정은 유전체 안정성을 유지하기 위해 정교한 과정을 필요로 한다. 오카자키 단편 처리는 flap 구조의 형성으로부터 시작되는데, flap의 염기 서열에 따라 2차 구조와 같은 여러 가지 구조가 형성될 수 있다. 이러한 구조는 기능이 다른 여러 가지 단백질의 상호작용에 의해 정교하게 처리될 수 있다. 본 논문에서는 오카자키 단편 처리 과정에서 Vts1과 Rad52가 어떻게 flap 구조를 처리하는지에 대해 설명하고 있다.
발아효모의 $\sl{VTS1}$ 유전자는 여러 진핵 생물에 유사한 유전자가 보존되어 있고, 염기서열과 구조 특이적인 RNA에 결합하는 단백질을 발현한다. 이 특이적인 RNA를 SRE-RNA라고 한다. Vts1 단백질은 mRNA의 번역되지 않는 3’ 말단에 포함된 SRE-RNA를 인식하여 전사 후 조절에 관여한다. 우리는 DNA helicase 활성이 없어진 돌연변이인 $\sl{dna2-K1080E}$의 multi-copy suppressor로 $\sl{VTS1}$ 유전자를 발견하였다. 정제된 Vts1 단백질은 Dna2 endonuclease 활성을 증가시키지만, 단백질 N-말단의 405개의 아미노산이 결실된 Dna2Δ405N의 endonuclease 활성은 증가시키지 않았다. 이는 N-말단 부분이 endonuclease 활성 증가에 영향을 주는 것을 의미한다. Dna2-K1080E의 과발현이 $\sl{dna2-K1080E }$돌연변이를 suppression 한다는 결과로부터 Vts1의 Dna2 endonuclease 활성 증가가 suppression 의 직접적인 원인임을 알 수 있었다. 우리는 이중 돌연변이인 $\sl{vts1Δ dna2Δ405N}$ 과 $\sl{vts1Δ dna2-7}$이 각각의 돌연변이에 비해 세포 성장이 현저하게 저하된 것을 토대로 이 두 유전자가 기능적으로 연관이 있음을 알 수 있었다. 이와 같은 in vivo와 in vitro의 실험 결과를 토대로 Vts1 단백질이 Dna2 endonuclease 활성을 조절하면서 지연가닥의 합성에 관련되어 있음을 알 수 있다.
Rad52는 상동 재조합 과정에서 RPA를 Rad51으로 대체하여 Rad51-ssDNA 구조를 형성하는데 필요한 단백질이다. 이 구조가 형성이 되면 상동적 염기서열이 있는 곳을 찾아 재조합이 시작된다. 우리는 $\sl{RAD52}$ 유전자를 $\sl{dna2-K1080E}$의 multi-copy suppressor로 발견하였다. 상동 재조합에서의 기능이 저하된 $\sl{rad52-QDDD/AAAA}$ 돌연변이는 $\sl{dna2-K1080E}$를 suppress 하지 못하였다. 이를 통해 $\sl{dna2-K1080E}$의 suppression이 상동 재조합을 통해 이루어짐을 알 수 있었다. $\sl{dna2Δ405N}$ 돌연변이는 야생형에 비해 재조합 정도가 증가함을 보였고, 정제된 DNA에서도 재조합의 중간 산물이 증가되었음을 보였다. 이는 Dna2의 기능이 저하될 경우, 상동 재조합을 통해 오카자키 단편 처리가 이루어질 수 있음을 나타낸다. 이중 돌연변이인 $\sl{rad52Δ dna2Δ405N}$ 의 현저한 세포 성장 저하는 오카자키 단편 처리 과정과 상동 재조합이 밀접하게 연관되어 있음을 알 수 있다. 이와 같은 결과를 토대로 우리는 상동 재조합을 통해 오카자키 단편을 처리하는 모델을 제시할 수 있었다. 3’ 말단 flap의 단일 가닥이 길어지거나 이중 가닥이 잘려지면서 형성되는 3’ 말단 단일 가닥이 상동 염기 서열을 찾아 재조합을 시작하고, 그 재조합이 종료됨에 따라 오카자키의 단편 처리가 완료될 것이다. 본 논문은 Vts1과 Rad52 단백질이 오카자키 단편 처리하는데에 있어 다양한 방법으로 이루어짐을 알 수 있었다. 이러한 다양한 방법들로 인해 오카자키 단편 처리 과정에서 중요한 역할을 하는 Dna2 기능이 저하되어도 많은 단백질들이 이를 도와주어 유전체의 안정성을 유지할 수 있음을 알 수 있었고, 이는 향후 유전체 안정성에 관련된 여러 질병을 연구하는 데에 있어서 많은 도움을 줄 것이라 생각된다.
