Quorum sensing is a cell-cell communication mechanism that is involved in the regulation of biological functions like luminescence, virulence, and biofilm formation. Quorum quenching enzymes, which interrupt quorum sensing signaling through degradation of quorum sensing-molecules, have emerged as a new approach to control and prevent bacterial virulence and pathogenesis. In order to increase the potential of the quorum quenching enzymes for practical applications, several attempts have been made to enhance their catalytic properties using rational and molecular evolution approaches. A genetic circuit was constructed based on acylhomoserine lactone (AHL)-mediated quorum sensing signaling as a high-throughput screening system for molecular evolution of quorum-quenching enzymes. The genetic circuit was composed of lux-R, lux-I promoter, $\beta$-lactamase, and $\beta$-lactamase inhibitor, and designed to confer antibiotic resistance to host cells expressing an AHL-degrading enzyme, enabling a rapid screening of quorum quenching enzymes. Using the genetic circuit, the directed evolution of the AHL hydrolase from $\It{Bacillus sp}$. was attempted in an effort to develop quorum quenching enzymes with improved catalytic activity. As a result, improved enzymes with increased catalytic activity compared to the wild type enzyme were identified, and the genetic circuit was shown to be effective in screening of quorum quenching enzymes with high catalytic efficiency. A structure-based rational design of the enzyme was attempted for targeted quorum quenching against bacteria. The amino acid hot spots crucial to substrate specificity were predicted based on a computational modeling and sequence alignment at the active site of the AHL hydrolase. The involved amino acids in the hot spot positions were rationally substituted, and the substrate specificity about AHLs was effectively modified. Isolation of new quorum quenching reagents broaden a pool of candidates for control of bacterial pathogenicity. In an attempt for this, screening of quorum quenching proteins from metagenome library was tried using the constructed genetic circuit. As a result, a novel protein with quorum quenching activity was indentified. These approaches are expected to be usefully applied in the development of anti-microbial candidates with greater potential.
미생물이 신호물질을 이용한 의사소통 즉 quorum sensing으로 생리적인 활성을 조절하며 사람 및 동식물에서의 감염성 질병 및 생물막 형성 또한 이 과정에 의해 이루어진다는 사실이 알려지게 된 이래로 이를 억제하여 질병 치료 및 예방을 하고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. Quorum sensing 신호 전달 물질을 분해하여 quorum sensing을 억제하는 quorum quenching 효소는 효과적인 미생물 저해 수단이 될 수 있으며 이를 이용하여 식물 또는 모델 동물의 감염성 질병을 막고 생존력을 높인 예가 많이 보고 되어 왔다. 그러나 효소 활성 및 기질특이성, 안정성 등을 개선하여 의학 및 산업적 적용의 잠재력을 높인 고기능 quorum quenching 효소를 개발하기 위해서는 효율적인 고속 선별 시스템을 갖춘 분자진화 기술, 3차 구조를 기반으로 한 효소의 합리적 설계 및 $\It{in silico}$ 설계 기술이 필수적이나 이에 대한 기술 구축이 미비한 실정이다. 본 연구에서는 바실러스 균 유래의 대표적인 quorum quenching 효소인 AHL 가수분해효소를 모델로 효소 개발을 위한 기반 기술을 구축하고 이를 이용해 고기능 미생물 저해 효소를 개발하고자 시도하였다.
첫째로 quorum quenching 효소 활성의 분자 진화를 위한 유전자 회로 방식의 고속 선별 시스템을 구축하였다. LuxR 전사조절단백질과 이에 의해 조절되는 발현 프로모터, 베타 락타마제와 베타 락타마제 저해 단백질로 구성된 유전자회로를 통해, quorum quenching 효소 활성을 효소 발현 숙주세포의 항생제 저항성과 연계하여 활성의 빠른 선별이 가능하도록 하였다. 그리고 이 선별 시스템을 이용한 분자진화 기법을 통해 바실러스 균 유래의 quorum quenching 효소의 활성을 개선하여 선별 시스템의 효과를 입증하였다.
둘째로 quorum quenching 효소의 3차 구조를 바탕으로 한 효소/기질 결합 모델링과 유사 서열 분석을 통해 효소의 기질 특이성을 설계하였다. 미생물마다 아실기의 길이와 모양이 다른 AHL을 quorum sensing 신호물질로서 사용하므로 유익한 미생물의 생리 활성은 방해하지 않으면서 특정 병원균만을 선택적으로 차단하여 미생물 저해의 효율을 높이는 것이 가능하다. 본 연구에서는 아실기의 길이에 따른 효소 활성의 특이성을 조절하기 위해 효소 활성부위의 기질 특이성 기여 아미노산을 컴퓨터를 이용한 시뮬레이션과 진화적 서열 정보를 바탕으로 예측하였고 이 부분의 돌연변이를 통해 quorum quenching 효소의 기질 특이성을 개선하였다.
셋째로 앞서 개발된 quorum quenching 활성 선별 시스템을 이용하여 자연계에서 새로운 quorum quenching 단백질을 찾고자 시도하였다. 기존의 효소를 개량하여 미생물 저해 단백질로서 가치를 높이는 것 이외에도 효율적인 후보 단백질을 자연계에서 새로이 찾아내는 것도 가능한 접근이다. 이를 위해 토양에서 얻어진 메타지놈 라이브러리를 quorum quenching 활성 선별 시스템에 적용하였으며 결과적으로 새로운 quorum quenching 후보 단백질을 선별하였다.
고기능 quorum quenching 후보 물질 개발을 위한 이러한 접근 방식들은 향후 새로운 미생물 저해제 개발을 위한 기반 기술로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
