Light is one of important environmental sources required for plant development. Plants obtain energy and information from light. Light informations such as wavelength, intensity, day length, and direction can be converted into biological information by photoreceptors. Photoreceptors are divided largely into three groups: phytochromes, cryptochromes, and phototropins. Phytochromes are red and far-red light photoreceptors. There are five phytochromes termed phytochrome A to phytochrome E. They undergoes photoconversion between two spectrally distinct forms, a red light absorbing form (Pr) and a far-red light absorbing form (Pfr). When phytochromes are irradiated with red light, they are converted into Pfr forms. And the Pfr forms are converted into Pr forms by irradiating far-red light. This photoconversion is reversible.
In this study, the role of phytochromes in regulating leaf curling was investigated. And also the role of phytochromes in integrating wavelength, intensity, day length, and direction information was investigated.
In long days (LD), some leaves of phytochrome mutants were flat shape, whereas most of wild type leaves were dome-like shape. In short days (SD), the upward curling was more severe than in LD. Some leaves of phytochrome mutants showed roll-like shape, and all of wild type leaves were flat shape. These data indicate that phytochromes mediate day length information to regulate leaf curvature.
To know whether intensity also affects the leaf curling, light intensity was varied both in LD and SD. When light intensity was reduced half in LD, the degree of upward curling was increased. When light intensity was increased double in SD, the curling degree was weak. These data indicate that phytochromes integrate day length and light intensity information to regulate leaf curling.
To understand the cause of leaf curling, leaf tissues such as epidermis and palisade were investigated. In SD, the epidermal cell sizes of both adaxial and abaxial were decreased in phyA phyB mutant when compared with wild type and the reduction of cell size of phyA phyB mutant was significant in adaxial side, whereas the reduction of abaxial epidermal cell size was slight. In wild type, the epidermal cell size of adaxial side was larger than that of abaxial side, showing the ratio of adaxial to abaxial (1.33). In case of phyA phyB, the ratio of adaxial to abaxial was 1.15. These indicate that phytochromes promote cell enlargement preferentially on adaxial side over on abaxial side. However, the small cell size of abaxial epidermal cells was compensated by increasing cell number. Therefore, to determine the balance between adaxial and abaxial sides, not only cell size but also cell number should be considered. Therefore a parameter, epidermal width (not epidermal cell width) which was calculated by multiplying average epidermal cell width by total epidermal cell numbers was used for measurement.
The epidermal widths both of adaxial and abaxial were larger in wild type than in phyA phyB mutants both in LD and SD, indicating that phytochromes promote epidermal expansion. However, the ratios of adaxial epidermal width to abaxial epidermal width were almost same in wild type and phyA phyB mutant. These suggest that the ratio of adaxial epidermal width to abaxial epidermal width is not likely the cause of upward curling.
In SD, the palisade cell size of phyA phyB mutant was obviously decreased when compared with that of wild type and the cell numbers of phyA phyB mutant were similar with that of wild type, indicating that the small cell size of phyA phyB mutant is not compensated by increasing cell number. Moreover, the degrees of packing, the % of area that is occupied by palisade cells per a unit area, were clearly different between wild type and phyA phyB mutant. The degree of packing was 85% in phyA phyB mutant, whereas 94% in wild type, indicating that the palisade cells of phyA phyB mutant are loosely packed. In LD, the size, number, and packing degree of palisade cells did not show a marked difference between wild type and phyA phyB mutant, consistent with the phenotype of phyA phyB mutant (no curling up in LD). These data imply that the reduction of both cell size and packing degree of palisade cells, located in adaxial side of leaf, might trigger upward curling of phyA phyB mutants.
식물의 발달에 있어 빛은 중요한 요소로 작용한다. 식물은 빛으로부터 빛 에너지와 빛 정보를 받아드린다. 빛에는 파장, 낮 길이, 방향성, 그리고 세기와 같은 정보가 들어있다. 식물은 광수용체를 통해서 이러한 빛 정보를 인지하고, 생물학적 신호로 전환시킨다. 빛 수용체로는 인지하는 빛 파장에 따라 크립토크롬 (cryptochromes), 포토트로핀 (phototropins), 그리고 파이토크롬 (phytochromes) 로 크게 구분할 수 있다. 파이토크롬은 적색광 (red) 와 원적색광 (far-red) 을 인지하는 광수용체로써, 파장에 따라서 그 구조가 변화하는 특성을 가진 단백질이다. 파장이 660nm 부근인 적색광을 받게 되면 Pfr (far-red light absorbing form) 로 전환되고, Pfr 형태가 파장이 730nm 부근인 원적색광을 받게 되면 Pr (red light absorbing form) 로 다시 전환되게 된다. 이러한 전환은 가역반응으로써 파장에 따라서 파이토크롬은 두 가지 형태 (Pfr 또는 Pr) 로 반복적으로 변환될 수 있다. 파이토크롬은 적색광에 의해 활성화 (Pfr) 되어 핵으로 이동하고, 원적색광에 의해 비활성화 (Pr) 되어 세포질로 이동한다. 핵으로 이동한 활성화된 파이토크롬은 다른 단백질들과 결합하여 그 역할을 수행하게 된다. 또한, 빛에 의해서 Pr 형태에 대한 Pfr 형태의 비율이 달라지게 된다. 예를 들어 원적색광에 비해서 적색광이 많으면, Pr 에 대한 Pfr 의 비율이 높아지게 될 것이다. 그리고, 파이토크롬의 Pfr/Pr 비율에 따라서 식물 세포내에서 일어나는 생물학적 반응도 변화하게 된다. 이와 같이 외부환경에서 오는 빛의 정보가 파이토크롬의 Pfr/Pr 비율로 전환됨으로써, 빛에 담긴 정보가 생물학적 정보로 전환될 수가 있다. 현재까지 씨앗의 발아, 초기발달(de-etiolation), 개화, 잎 발달 등에 파이토크롬이 관여하는 것으로 밝혀져 있다.
본 연구에서는 잎의 발달, 특히 잎의 굴곡(말림)을 조절하는데 있어 파이토크롬의 역할을 규명함으로써, 파이토크롬이 빛 정보를 어떤 방식으로 생물학적 정보로 전환하는지에 대해서 알아보고자 하였다. 야생형 (wild type) 잎은 낮 길이가 긴 조건 (long days) 에서 잎 끝이 아래방향으로 향하게 된다. 그 단면을 보았을 때 돔과 비슷한 (dom-like) 모양을 하게 된다. 낮 길이가 짧은 조건 (short days) 에서는 야생형 잎 단면은 평평한 (flat) 형태를 취하게 된다. 반면 파이토크롬 돌연변이체 잎은 야생형 잎과 비교했을 때, 잎이 위로 말리는 표현형을 보이게 된다. 낮 길이가 긴 조건에서는 평평한 잎이 차지하는 비율이 높게 되고, 낮 길이가 짧은 조건에서는 잎이 위로 말리거나 (curled), 롤 (roll) 모양으로 완전하게 말려진 (rolled) 잎도 생기게 된다. 잎이 말리는 표현형은 이와 같이 낮이 긴 조건 보다 낮이 짧은 조건에서 더 심해지게 된다. 이러한 표현형을 통해서 파이토크롬이 '낮 길이' 라는 빛 정보를 인지하여 잎 말림을 조절한다는 것을 알 수 있었다.
빛 세기가 잎 말림에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해서, 즉 파이토크롬이 빛 세기 정보를 어떤 식으로 해석하여 잎 말림을 조절하는지 확인하기 위해서, 낮이 긴 조건과 낮이 짧은 조건에서 각각 빛의 세기 변화시켜 보았다. 낮 길이가 긴 조건에서 빛 세기를 반으로 줄였을 때, 위로 잎 말리는 현상이 관찰되었다. 그리고, 낮 길이가 짧은 조건에서 빛 세기를 두 배로 증가했을 때, 여전히 위로 잎 말리는 현상이 관찰되었다. 단, 빛 세기를 증가시켰을 때, 잎 말림의 정도가 감소함을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과를 통해서, 파이토크롬이 낮 길이뿐만 아니라 빛 세기 정보도 인식하여 잎 말림을 조절한다는 것을 확인할 수 있었다.
잎 말림 표현형의 원인을 알아보기 위하여, 잎을 구성하고 있는 표피세포와 펠리사이드 (palisade) 세포를 분석하였다. 먼저 표피세포의 경우, 야생형과 파이토크롬 돌연변이체 모두 아랫면에 대한 윗면의 세포 팽창 비율이 비슷했다. 아랫면에 대한 윗면의 비율이 거의 1에 가까웠다. 이것은 윗면과 아랫면 표피세포의 세포 팽창이 비슷하게 일어나고 있다는 것을 의미했다. 또한 이 결과를 통해서 잎 말림이 윗면, 아랫면 표피세포 팽창 비율에 의한 것이 아님을 확인할 수 있었다. 펠리사이드 세포의 경우 낮 길이가 짧은 조건에서 야생형과 비교했을 때 파이토크롬 돌연변이체에서 펠리사이드 세포 크기가 줄어들어있었다. 반면 세포수를 비교했을 때 야생형과 파이토크롬 돌연변이체 가 큰 차이를 보이지 않았다. 즉, 파이토크롬 돌연변이체 잎에서는 세포 크기가 작아졌다고 해서 세포 수가 늘어나지는 않았다. 펠리사이드 세포가 얼마나 촘촘하게 밀집되어 있는지에 대해서도 측정해보았다. 펠리사이드 세포들 간에 빈 공간을 측정함으로써 세포의 패킹 정도 (degree of packing) 를 계산하였다. 야생형에 비해서 파이토크롬 돌연변이체에서는 패킹 정도가 약했다. 즉 파이토크롬 돌연변이체에서는 펠리사이드 세포들이 느슨하게 분포되어 있었다. 아마도 파이토크롬 돌연변이체에서는 윗면을 구성하고 잇는 펠리사이드 세포들이 느슨하게 분포됨으로써 잎이 위로 말렸을 것이라 추측할 수 있었다. 잎 단면상에서 윗부분을 차지하고 있는 펠리사이드 세포들의 패킹 정도가 잎의 말림을 결정짓는 원인일 것이라 생각할 수 있었다. 낮 길이가 긴 조건에서는 야생형과 파이토크롬 돌연변이체 간에 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과로부터 파이토크롬이 낮 길이를 인지하여 펠리사이드 세포 발달을 촉진함으로써 잎이 위로 말리는 현상을 억제한다고 볼 수 있었다.
파이토크롬에 의해 펠리사이드가 위치한 윗면 발달이 영향을 받고 있는 사실로부터 파이토크롬이 잎의 아랫면 보다 윗면에서 좀 더 강한 활성을 가진다고 유추할 수 있었다. 이러한 가능성을 확인하기 위해서 잎의 윗면과 아랫면에서의 원적색광과 적색광을 측정해 보았다. 위에서 아래로 빛을 주었을 때 잎 아랫면까지 도달하는 적색광은 원적색광에 비해서 현저히 적었다. 이것은 잎 속에 있는 크로로필이 적색광을 선호하여 흡수하기 때문이 일어나는 결과였다. 빛 투과율 측정을 통해서 윗면이 원적색광에 대한 적색광의 비율이 아랫면 보다 높음을 알 수 있었고, 적색광의 비율이 높은 윗면에서 파이토크롬의 Pfr 형태도 함께 증가할 것으로 추측할 수 있었다. 파이토크롬이 실제 잎 윗면에서 좀 더 활성이 강하다는 것을 증면하기 위해서, 파이토크롬과 녹색형광단백질 (GFP) 이 결합된 단백질을 발현하는 형질전환 식물체를 사용하였다. 파이토크롬 스펙클 개수를 잎의 윗면, 아랫면에서 각각 측정했을 때, 아랫면 보다 윗면에서 파이토크롬 스펙클 개수가 더 많았다. 이것은 윗면에서 파이토크롬의 활성이 더 높다는 것을 보여주는 실험 결과였다. (파이토크롬 Pfr 형태는 스펙클을 형성하는 것으로 알려져 있다.)
이러한 결과는 파이토크롬의 Pfr/Pr 비율이 윗면에서 높고 아랫면으로 갈수록 낮아지는, 즉 Pfr/Pr 비율에 대한 기울기가 생김을 의미하였다. 다시 말해 위에서 아래로 향하는 빛의 방향성이 파이토크롬에 의해서 Pfr/Pr 비율 기울기로 전환된다고 볼 수 있었다. 파이토크롬이 빛의 방향성이라는 빛 정보를 조절함을 밝히기 위해서, 빛을 잎의 아랫면에서 주었다. 그 결과 윗면에서의 파이토크롬 스펙클 개수는 줄어들고, 아랫면에서의 스펙클 개수는 증가함을 알 수 있었다. 이것을 통해서 빛의 방향에 따라서 파이토크롬의 Pfr/Pr 비율 기울기가 변할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 빛 방향성에 의해 잎의 말림 표현형이 변화가 있는지 관찰해 보았다. 식물 밑에 알루미늄 호일을 깔아서 잎의 아랫면에 빛을 추가로 주었을 때, 야생형 식물의 잎이 위로 말리는 현상을 관찰할 수가 있었다. 이러한 결과는 파이토크롬이 빛의 방향성을 인지하여 잎 말림을 조절한다는 것을 보여주었다.
이 논문을 통해서 파이토크롬이 빛 세기, 낮 길이, 그리고 빛의 방향성을 통합하여 식물의 잎 발달을 조절함 보였다.
