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Integrated polymerase chain reaction and capillary electrophoresis microdevice for pathogen detection and cancer diagnostics = 중합효소연쇄반응과 전기영동 마이크로 통합 디바이스를 이용한 병원체 규명 및 암 진단에 관한 연구
서명 / 저자 Integrated polymerase chain reaction and capillary electrophoresis microdevice for pathogen detection and cancer diagnostics = 중합효소연쇄반응과 전기영동 마이크로 통합 디바이스를 이용한 병원체 규명 및 암 진단에 관한 연구 / Se-Jin Kim.
저자명 Kim, Se-Jin ; 김세진
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2010].
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Microfluidic technology has paved its way in a variety of chemical and biological applications due to the benefits such as small sample consumption, high throughput screening capability, fast analysis time and portability. DNA amplification based on polymerase chain reaction (PCR) and capillary electrophoresis (CE) DNA separation are the most indispensable technique for molecular diagnostics. In this study, we adopted microtechnology to miniaturize the PCR reactor in a nanoliter scale combined with an advanced micro-CE $(\mu u CE)$ system for highly sensitive and resolved pathogen detection and cancer diagnostics. As a first part, we developed a capillary electrophoretic microdevice for high-resolution multiplex pathogen detection by using single strand conformation polymorphism (SSCP) technique. In particular, we explored the capability of poly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide) (PEO-PPO-PEO) triblock copolymer as a sieving matrix in the CE microchannel to separate the single-stranded DNA molecules with high resolution. To demonstrate superior resolving power of PEO-PPO-PEO copolymers, 255-bp PCR amplicons obtained from the 16S rRNA genes of four bacterial species, namely Proteus mirabilis, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis were analyzed in the PEO-PPO-PEO matrix in comparison with 5% linear polyacrylamide (LPA) and commercial GeneScanTM gels. Due to the enhanced dynamic coating and sieving ability, PEO-PPO-PEO copolymer displayed 4-fold enhancement of resolving power in the CE-SSCP to separate the same sized DNA molecules in about ~11 min. The produced peaks in the electropherogram were correlated well with the amount of genomic DNA templates, enabling correct quantitative analysis in the pathogen detection. Besides the high resolution sieving capability, a facile loading and replenishment of gels in the microchannel owing to the thermally reversible gelation property makes PEO-PPO-PEO triblock copolymer an excellent matrix in the CE-SSCP analysis on the microdevice. As a second part, we applied the integrated PCR-CE microdevice for telomerase activity screening for cancer diagnostics. The telomerase enzyme, which maintains telomere length at the end of chromosomes in cancer cells, was extracted from the human breast cancer cells (MCF-7) and telomeric repeat amplification protocol (TRAP)-based genetic analysis was performed on the off-chip and on-chip basis. TRAP assay consists of a two-step in which telomerase first adds telomeric repeats (TTAGGG) onto the 3`-end of the substrate oligonucleotide, and then in a second step, the extended products are amplified by polymerase chain reaction. We analyzed the resultant 6-bp tandem repeat PCR amplicons in the $\mu$ CE device within 4 min with a limit of detection of 50 cells. Furthermore, we used an integrated PCR-CE microdevice which incorporates 160 nL PCR chamber and 7 cm CE microchannel to conduct PCR amplification and separation subsequently. The rapid ramping rate of PCR and CE operations enables the TRAP assay to be completed within 1.6 h. The PCR-mediated elongation of telomerase products was successfully observed along with an internal standard, confirming the telomerase activity of MCF-7 cancer cells. These results demonstrated high potential of microfabricated PCR and CE device for point-of-care genetic analysis to be applied for pathogen detection, biomedical cancer diagnostics, and food safety testing.

마이크로 플루이딕 기술은 생화학 분야에서 다양하게 응용되고 있는 기술이다.이 기술은 적은 량의 시약을 소모하면서 짧은 시간에 높은 효율로 스크리닝을 할 수 있고, 소형화가 용이하여 현장에서 바로 분석 결과를 얻을 수 있는 휴대용 장치로서 구현이 가능한 장점을 가지고 있다. DNA 분자 진단 기술에서는 소량의 DNA를 증폭하는 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)과 DNA를 길이에 따라 분리할 수 있는 미세 전기 영동법(Capillary electorphoresis)이 필수적인 기술이다. 우리는 마이크로 플루이딕 기술을 기반으로 제작된 나노리터 규모의 마이크로 PCR 반응기와 마이크로 채널을 이용한 미세 전기영동법을 이용하여 병원체 규명 및 암 진단을 실시하였다. 먼저 병원체 규명을 위하여 Single Strand Conformation Polymorphism(SSCP)기술을 이용한 고 분해능 미세 전기영동 디바이스를 개발하였다. 특히 poly(ehtyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly(ethlyeneoxide) (PEO-PPO-PEO) 삼중합체 고분자가 Sieving matrix로서 Single strand DNA를 분리하는데 가장 좋다는 것을 이용하여 이를 마이크로 칩에 적용하였다. 분리할 DNA는 여러 종류의 박테리아 (Proteus mirabilis, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitides) 로부터 추출된 16S rRNA 유전자를 이용하였다. 각각의 박테리아에서 추출된 16S rRNA 유전자로부터 증폭된 PCR 생성물은, 길이가 모두 255bp로 일정하며 염기서열만 다르다. PEO-PPO-PEO 고분자의 분리능을 비교하기 위하여 다른 종류의 Sieving matrix인 5% 선형 폴리아크릴아마이드 (Linear polyacrylamide, LPA)와 시중에서 구입할 수 있는 $GeneScan^{TM}$ 을 준비하여, PEO-PPO-PEO 고분자와 같은 방법으로 16S rRNA 유전자를 분리, 분석하였다. 그 결과 PEO-PPO-PEO 고분자가 다른 Sieving matrix에 비해 분해능이 4배 정도 향상된 결과를 11분 안에 확인할 수 있었다. 이어서 박테리아의 정량분석을 위하여, DNA template의 농도를 조절하여 분석결과를 비교 분석하여 보았다. 그 결과, 해당 template의 생성 Peak의 넓이가 template의 농도에 정비례 함을 알 수 있었다. 마지막으로 PEO-PPO-PEO 고분자는 실온에서는 점도가 물에 가깝고, 온도가 점점 올라갈수록 점도가 높아지는 특징을 가지고 있다. 이는 보통 점도가 높은 고분자를 CE 채널에 채우는 데에 발생하는 어려움을 해결할 수 있었다. 두 번째로 암 진단을 위해 PCE-CE 통합 마이크로 장치를 이용하여 텔로머라아제(Telomerase)의 활동성을 모니터 하였다. 텔로머라아제는 염색체 말단에 존재하는 텔로미어(Telomere)의 길이를 유지해주는 역할을 하는 효소로 주로 암세포나 줄기세포에서 활동을 한다. 우리는 인간 유방암세포(MCF-7)로부터 텔로머라아제를 추출하여 telomeric repeat amplification protocol (TRAP) 분석을 실시하였다. TRAP 분석은 먼저 텔로머라아제가 oligonucleotide 말단에 telomeric repeats (TTAGGG)을 합성하게 한다. 그리고 이렇게 합성된 oligonucleotide를 중합효소반응으로 증폭을 시킨다. 먼저 우리는 CE 장치를 이용하여 3분 안에 CE칩을 이용하여 6bp 단위로 반복 증폭된 DNA를 검출하였다. 이 방법의 검출한계는 50 개의 세포까지였으며, 세포의 수가 늘어날수록 검출되는 DNA의 양은 증가하여 선형성을 보였다. 또한 우리는 나노리터 사이즈의 중합효소반응기과 CE가 통합된 칩을 이용하여 DNA의 증폭과 분리를 연속적으로 실시하였다. 빠른 온도변화와 짧은 반응 시간으로 1시간 안에 TRAP 분석을 완료 하였으며, 인간 유방암으로부터 추출된 텔로머라아제의 생성물을 성공적으로 관측하였다. 이러한 결과는 마이크로 플루이딕기술 기반으로 제작된 나노리터의 PCR 반응기와 CE 장치가 병원균 검출, 암 진단이나 식품 안전 검사에 이용되는 유전자 분석을 훌륭하게 수행할 수 있음을 보였다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {MCBE 10003
형태사항 iv, 54 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김세진
지도교수의 영문표기 : Tae-Seok Seo
지도교수의 한글표기 : 서태석
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 Reference: p. 49-52
주제 CE-SSCP
PEO-PPO-PEO
pathogen
telomeric repeat amplification
capillary electrophoretic microdevice
미세전기영동-단일쇄 형태변환 다형성
PEO-PPO-PEO
병원체
TRAP
미세전기영동 마이크로 디바이스
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