We have recently developed a fusion protein, which simultaneously blocks VEGF and angiopoietins, namely Double anti-angiogenic protein (DAAP). These molecules are known to serve a crucial role in tumor angiogenesis and vascular leakage. I have assessed the efficacy and safety of DAAP as means of a preclinical study. DAAP was purified from stable CHO cell line manipulated to express DAAP, which was found to show synchronous binding to VEGF-A and Ang2 by ELISA analysis. It also inhibited the migration of HUVECs induced by VEGF-A in vitro. For in vivo evaluation, DAAP was administered subcutaneously at a dose of 25 mg/kg (body weight) in wild-type C57BL/6J mouse every 3 days to assess any potential toxicity. All mice survived and maintained their normal body weight. The white blood cell (WBC) counts and differential leukocytes ratio were within reference range. No abnormalities in the levels of blood urea nitrogen (BUN), creatinine, aspartate aminotransferase (AST), and alanine aminotransferase (ALT) were observed. In addition, blood pressure and pulse rate were within reference range. However, DAAP administered mouse increase the hematocrit level that indicates the capability of in vivo VEGF-A neutralization, and the risk of thrombosis. In conclusion, DAAP purified from CHO cells is a promising anti-angiogenic recombinant protein drug with high efficacy and safety except the increasing hematocrit.
신생 혈관 억제를 통한 암 치료는 신생 혈관을 유도하는 단백질 신호를 특정 표적단백질 또는 항체로 억제하여 암세포를 굶어 죽이는 방법을 말한다. 미국 신생혈관재단은 2004년 제넨텍사의 아바스틴이 말기대장암 환자 표적항암제로 미국 FDA의 승인을 받은 이후로 현재까지 12개의 신약이 승인을 받았다고 보고하고 있다. 이러한 신약들은 모두 신생 혈관 억제를 위해 중요한 혈관 신생 유도 신호인 혈관내피성장인자(VEGF) 신호체계를 막는 전략을 취하고 있다. 하지만 최근 신생혈관의 연구를 통해 밝혀진 안지오포에틴(Angiopoietin)을 막는 신약을 아직 개발되지 않았다. 이에 본 연구실은 위 두 단백질을 동시에 막아 혈관 생성을 억제하는 재조합 치료단백질을 개발하여 DAAP이라 명명하였다.
이러한 DAAP이 신약으로 승인 받기 위해서는 안정적인 생산 및 정제와 전임상 동물 모델에서의 안전성이 먼저 입증되어야 한다. 따라서 이미 많은 생물학적 신약의 생산을 하는 중국햄스터난소세포(CHO)의 유전자 조작을 통해 만들어진 재조합 단백질 생산세포주를 키우면서 높은 생산성을 만들기 위한 다양한 조건 설정과 3차원 세포 배양 적응 과정을 거쳤다. 그리고 세포를 키운 배양액을 모아 단백질을 정제하였다. 실험을 위해 정제된 재조합 단백질들은 동물 실험을 수행 할 수 있는 생산성과 높은 순도를 보였다. 그리고 정제된 단백질의 생화학적 특성을 알아보기 위해 분자생물학 실험을 수행하여 DAAP 단백질 만이 암세포의 주요혈관생성인자인 혈관내피성장인자-A와 안지오포에틴-2를 잡을 수 있음을 확인하였다. 그리고 인간제대정맥내피세포(HUVEC)에서 DAAP은 혈관내피성장인자에 의한 생물학적 활성을 저해하는 것을 확인하였다.
다음으로 이러한 DAAP의 효능이 동물모델에서도 재현이 되고 안전성을 가지는지 확인하기 위해 대표적인 실험동물인 C57BL/6J 쥐에 각각의 치료단백질을 25mg/kg 용량으로 3일마다 피하주사법 주사를 하였다. 그 결과 실험을 수행한 27일 동안 모든 쥐가 특이사항 없이 일반적인 체중 증가를 보이며 살아남아 치명적인 독성은 없는 것을 확인하였다. 그리고 정상적인 혈압과 맥박, 혈청 내에 면역세포의 수를 보였다. 그리고 간 독성을 보기 위해 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)와 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 측정하여 정상인 것을 확인하고, 혈액과 뇨 중 요소값(BUN)과 혈청 크레아틴을 측정하여 신장독성도 없는 것을 확인했다. 그리고 심장, 뇌, 간, 폐, 신장조직의 생검 H&E 결과 정상적인 형태를 보이고 특히 심장의 좌심실 비대증은 없었다. 또한 면역조직화학법을 통해 호흡관과 귀 피부의 혈관을 본 결과 전체적으로 정상적인 구조를 보였다. 다만 적혈구용적률은 정상범위보다 높은 결과가 나와 혈청학적 독성이 있음이 확인 되었다. 하지만 이러한 높은 적혈구 용적률은 신생혈관억제신약 처리 후에 보이는 일반적인 특성으로 DAAP이 다른 신약처럼 전임상에서 혈관억제 효능을 가진다는 증거가 된다. 이상의 결과를 통해 DAAP은 전임상에서 치료단백질로서의 효능을 가지면서 또한 높은 안전성을 가진다고 볼 수 있다.
