Colorimetric biosensors for the detection of biologically important molecules such as DNA, protein, ligands, and so on have been intensively investigated since it enables visual detection without the need for any detection equipment. Recently, noble metal nanoparticles especially gold nanoparticles (AuNPs) have been developed as a new family of biomarkers for the colorimetric detection of DNA. In this study, the development of colorimetric detection method for polymerase chain reaction (PCR)-amplified nucleic acids and its application for the diagnosis of pathogen infection and single nucleotide polymorphisms (SNPs) were described.
Firstly, we have developed a greatly simplified colorimetric detection method to identify PCR-amplified nucleic acids. Our method relies on the PCR product having thiol group at one end, which is generated by employing thiolated PCR primer. After PCR amplification reaction, unmodified AuNPs are added into the reaction tube followed by the addition of NaCl to induce the aggregation of AuNPs. The PCR products strongly bind to the surface of AuNPs through the interaction of the thiol group at the end and the abundant negative charges of the bound DNAs enhance the electrostatic repulsion among AuNPs, which consequently leads to the prevention of the salt-induced aggregation. As a result, the color of AuNPs remains red in the presence of the PCR-amplified nucleic acids, while the AuNPs change its color from red to blue due to the salt-induced aggregation in the absence of the PCR products. This simple but very efficient colorimetric strategy was successfully demonstrated by diagnosing Chlamydia infection using a real human urine sample. Since the results can be clearly seen with the naked eye without any complicated step such as surface modification of AuNPs or PCR product purification, this method can be easily applied to point-of-care diagnosis.
Furthermore, simple colorimetric method for SNPs detection using AuNPs and thiolated PCR product has been developed. First, we performed PCR using human genomic DNA as a template with thiolated forward primer to obtain one-side thiolated PCR amplicon. When they are mixed with AuNP solution, they bind to the surface of AuNPs and prevent aggregation induced by salt addition as we have observed previously. Based on these phenomena, we designed forward primers which have thiol group at 5’ end and single base mutation site at 3’ end to obtain thiolated PCR product only in the case of perfectly matched cases. When target DNA is wild-type, thiolated amplicon is generated by PCR amplification and shows red color when they are mixed with AuNPs followed by NaCl. In contrast, when the target DNA has single base mutation, PCR is not performed and shows blue color due to the absence of thiolated PCR amplicons. Applicability of this strategy was tested with breast cancer susceptibility gene BRCA1 and verified by conventional direct sequencing technology. This new method enables simple and reliable detection of SNPs without any specialized equipment.
To the best of our knowledge, this is the first approach employing thiolated PCR primer for colorimetric detection of nucleic acids using AuNPs. The utility of this strategy was demonstrated by its application to the detection of the disease causing bacterium, C. trachomatis in a human urine sample and genetic mutations in BRCA1 gene which are associated with the development of breast and ovarian cancers. The significance of this investigation lies in the discovery of a greatly simplified method for DNA detection. As a consequence of its simplicity, the methodology should find wide application in assays performed in hospital environments or in developing countries, where only a thermal cycler and non-highly trained personnel need to be available.
유전자의 발색 진단 방법은 특별한 장비의 도움없이 육안으로 진단이 가능하다는 점에서 매우 큰 장점을 가진다. 그 중에서도 금 나노입자를 이용한 방법은 용액의 색 변화만으로 표적 물질의 검출이 가능하기 때문에 많은 연구에 응용되어 왔다.
금 나노입자 용액은 입자의 크기에 따라 색깔이 다른 광학적 특성을 갖는다. 또한 입자들이 점점 뭉쳐짐에 따라 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance;SPR) 흡수 파장대가 이동하면서 색 전이를 나타낸다.
본 연구에서는 아무런 표지를 하지 않은 금 나노입자와 티올기를 표지한 중합효소연쇄반응 (PCR) 프라이머를 이용한 새롭고 간편한 유전자 발색 진단 방법을 개발하였다. 한 쪽 프라이머에만 티올기를 표지하여 중합효소연쇄반응을 수행하면, 증폭된 유전자의 한 쪽 끝이 모두 티올기를 갖게 된다. 티올기와 금 나노입자 표면간의 강한 결합력으로 인해 이들 증폭된 유전자들은 금 나노입자 표면에 단단하게 고정되고, 금 나노입자 표면의 음전하를 증가시킨다. 또한 금 나노입자의 크기에 비해 길이가 매우 긴 증폭된 유전자가 각 입자들의 표면에서 일종의 고분자 장벽 (polymeric barrier)을 형성하여 입자들끼리 서로 뭉치지 않고 분산된 상태로 있게 한다. 따라서 이들은 염의 첨가로 야기되는 나노입자들의 침전을 막아주어 염의 첨가 후에도 여전히 분산된 형태로 남아있어 붉은 색을 나타낸다. 증폭된 유전자가 존재하지 않을 경우에는 염을 첨가하였을 때 금 나노입자 표면의 전하가 상쇄되기 때문에 입자들끼리 서로 뭉쳐져 파란색을 나타낸다. 따라서 증폭된 유전자의 존재 유무를 색깔 차이로 구분할 수 있다.
이와 같은 방법을 이용하여, 제 1장에서는 비뇨생식기 감염균인 클라미디아 트라코마티스 병원균을 검출하였다. 먼저 병원균에 감염된 사람과 감염되지 않은 사람으로부터 추출한 유전자를 티올기를 표지한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 클라미디아 균의 유전자를 가진 시료의 경우에는 중합효소연쇄반응을 통해 유전자가 증폭되어 이를 금 나노입자 및 염과 혼합해 주었을 때, 입자들의 침전을 막아주어 붉은 색을 나타내었다. 반면, 클라미디아 유전자가 존재하지 않는 경우에는 중합효소연쇄반응이 일어나지 않아 증폭된 유전자가 존재하지 않게 되고, 금 나노입자 및 염과 혼합하였을 때 입자들이 침전되어 파란색을 나타내었다. 따라서 병원균의 감염 유무를 육안으로 성공적으로 진단할 수 있었다.
제 2장에서는 단일 염기 돌연변이의 검출에 본 방법을 응용하였다. 티올기가 표지된 프라이머의 3’ 말단이 돌연변이가 일어난 위치가 되도록 디자인 함으로써, 단일 염기 돌연변이가 일어나지 않은 경우에는 중합효소연쇄반응이 일어나고, 단일 염기 돌연변이가 일어난 경우에는 중합효소연쇄반응이 일어나지 않게 하였다. 마찬가지로 이들을 금 나노입자 및 염과 반응시켜 돌연변이가 일어난 시료를 검출해 낼 수 있었다.
본 연구는 티올기를 표지한 중합효소연쇄반응 프라이머를 사용하여 금 나노입자의 발색 진단에 응용한 최초의 시도이다. 또한, 기존의 보고된 방법들과 비교하여 볼 때, 금 나노입자의 표면을 표지하는 과정을 필요로 하지 않고, 중합효소연쇄반응 후의 추가 과정이나 증폭된 유전자의 정제없이 금 나노입자 및 염과의 단순한 혼합만으로 시료들이 분석될 수 있는 장점을 가진다. 따라서 본 연구를 통해 개발된 방법은 일반 지역 병원 또는 개발 도상국과 같이 고도의 전문가 및 고가의 분석장비 사용이 어려운 곳에서도 쉽고 간편하게 사용될 수 있을 것이다.
