The dissociated neuronal culture in vitro combined with electrical instrumentation interface systems is widely used as experimental model systems for the study of learning and memory mechanism in neuronal network of brain and nerve systems. In order to solve technical problems of randomly cultured neuronal network on MEAs such as the lack of experimental reproducibility and complex connectivity and to improve the similarity between culture system and actual nerve system, an agarose hydrogel-based neuron patterning method for making neuronal micro-cluster network (NMCN) is suggested. The NMCN on an MEA consist of neuronal micro-clusters aligned on microelectrodes of an MEA and neurite bundles connecting the neuronal micro-clusters. The biological growth properties and synapse distribution of NMCN was analyzed through immunostaining and image processing. The electrical activity including spontaneous activity and stimulation-evoked activity of NMCN were measured with an MEA and the analysis method for classifying electrical activity pattern of NMCN was proposed. The final goal of this work was to propose an electrical stimulation protocol based on STDP (spike timing dependent plasticity) theory for inducing neuronal network plasticity and to investigate the effect of proposed stimulation protocol. The analysis method for the quantification of NMCN electrical activity was used for analyzing the effect of stimulation protocol. The result shows strengthened synaptic pathway between NMCN nodes that proved the effectiveness of proposed electrical stimulation. The presented methods for making reproducible neuronal network pattern, analyzing the electrical activity and inducing network plasticity is expected to be utilized in in vitro research of learning and memory mechanisms of neuronal network level.
전자 계측 시스템과 결합된 신경세포의 생체 외(in vitro) 박리배양법은 뇌와 신경계에서 일어나는 기억과 학습의 기작을 연구하기 위한 실험 모델로서 널리 사용되고 있다. 미세전극칩(MEA)에 신경세포를 박리배양할 때의 기술적인 문제인 실험의 재현성 부족과 신경회로망의 과도한 복잡도를 해결하고 신경회로망의 구조를 실제 신경계에 보다 가깝게 모사하기 위하여, 아가로즈 하이드로겔 기반의 신경세포 패터닝 기법을 이용하여 제작한 신경 미세군집 회로망(neuronal micro-cluster network, NMCN)을 제시하였다. 미세전극칩 상의 NMCN에서 신경회로망은 신경세포의 군집들이 전극들 상에 위치하고 그 사이를 잇는 통로를 통해 신경돌기들의 다발이 연결되는 구조를 가진다. 배양된 NMCN의 생물학적 특성과 시냅스 분포를 면역염색법과 화상처리 기법으로 분석하였으며, MEA를 이용해 신경회로망의 전기적 활동 특성, 즉 자발적 활성과 자극에 대한 유발 반응을 측정하고 분석하였다. 최종적으로 배양된 신경 미세군집 회로망에서 신경군집간의 시냅스 연결도를 조절하기 위한 전기 자극 훈련법을 제시하고 그 실험의 결과를 분석하여 제시된 전기 자극 훈련법이 신경군집 간의 시냅스 경로를 강화시키는 효과를 가짐을 보였다. 이러한 재현성있는 신경회로망 패터닝과 설계된 신경회로망의 전기적 활성의 분석 방법, 그리고 신경회로망 가소성 조절 방법들은 네트워크 단계에서의 학습과 기억의 기작에 대한 생체 외 연구에 유용하게 활용될 것으로 전망한다.
