The RPA32 protein is involved in various DNA repair systems such as nucleotide excision repair (NER), base excision repair (BER), and homologous recombination. In these processes, RPA32 interacts with different binding partners at its C terminal common binding site (172-270; RPA32C). It has been reported recently that RPA32C also interacts with TIPIN during the intra-S checkpoint. During S phase TIM-TIPIN complex is present in replication foci and RPA32 facilitate the complex near the replication fork during the intra-S checkpoint. RPA32 facilitates the TIM-TIPIN complex, by direct interacting with TIPIN and the checkpoint response alleviates efficiently during the checkpoint response. Here, we show that TIPIN(185-218), which shares high sequence similarity with XPA(10-43) and UNG2(56-89), is disordered in free state and becomes structured upon binding to RPA32C with accompanying helix formation. The binding interface between TIPIN(185-218) and RPA32C is not exactly similar rather it has two binding sites compared to those of XPA- and UNG2-RPA32C complexes. Also, the binding affinities of those proteins towards RPA32C are comparable suggesting that DNA repair, homologous recombination, and checkpoint processes regulated by RPA32 in a competitive manner with comparable binding affinity.
RPA는 DNA의 복제, 조합, 수리의 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질이다. 32kDa의 RPA32 도메인은 다양한 DNA 수리 과정에 직접적으로 작용하는 단백질 도메인으로 NER, BER, Homologous recombination과 같은 다양한 기작에 참여한다. RPA32는 자신의 C-terminus 말단의 결합 도메인을 통해서 다양한 단백질들과 상호작용하며 DNA의 수리에 관여하게 된다. 최근 이 RPA32C가 intra-S checkpoint에서 TIPIN 단백질과 상호작용하여 TIM-TIPIN 단백질 결합체의 기능을 활성화시킨다고 보고된 바 있다.
이 논문에서는 NMR 분석을 통하여 TIPIN(185-218) 단백질이 RPA32C에 결합하는 구조를 분석하였고, 그 결과를 통해 TIPIN 단백질 도메인이 아미노산 서열이 높은 유사성을 갖는 XPA(10-43), UNG2(56-89) 단백질과 비슷한 형태로 RPA32C 단백질과 상호작용한다는 것을 알 수 있었다. TIPIN(185-218) 단백질은 다른 상호작용 단백질이 결합하지 않은 상태에서는 불규칙한 구조를 갖고 있으나 RPA32C 단백질과의 결합 후 헬릭스 구조를 형성하며 안정화되는 것을 확인할 수 있었다. 구조 분석 결과 TIPIN(185-218) 단백질의 결합 부분은 XPA(10-43)와 UNG2(56-89) 단백질이 RPA32C와 결합하는 부분과는 정확히 일치하지 않았으며 또한 다른 실험들을 통해서 큰 차이의 binding affinity를 보이는 것을 정량화할 수 있었다.
결론적으로 NMR과 CD 실험을 통해 RPA32C와 TIPIN 단백질 간의 직접적인 상호작용을 연구할 수 있었고, 이러한 상호작용의 연구 결과를 통하여 RPA 단백질이 주로 관여하는 DNA repair와 TIPIN 단백질이 주로 관여하는 DNA checkpoint pathway라는 두 서로 다른 DNA의 기작 간의 연결고리를 만들어 준다고 결론지을 수 있었다.
