Polylactic acid (PLA) is a promising biomass-derived polymer that possesses material properties suitable for household products, commercial plastics, and biomedical materials. However, PLA is currently synthesized by a two-step process: fermentative production of lactic acid followed by complicated chemical polymerization. In this study, $\It{Escherichia coli}$ strains have been developed for one-step production of PLA homopolymer and its various copolymers composed of lactate and hydroxyalkanoates monomers. $\It{E. coli}$metabolism was rationally modified by systems-level metabolic engineering based on $\It{in silico}$ genome-scale metabolic flux analysis to reduce by-products formation, increase the metabolic flux towards lactyl-CoA, and ultimately to enhance biosynthesis of PLA polymers. For more efficient production of PLA polymers, the metabolic pathways were reengineered so that induction with an expensive inducer for the gene expression and feeding of dicarboxylic acid for the cell growth could be avoided. Also, type II PHA synthases from various $\It{Pseudomonas}$ strains were engineered for the production of PLA polymers, which allowed diversification of natural variants of lactate-polymerizing enzyme. Furthermore, various PLA copolymers including poly(lactate-$\It{co}$-glycolate) could be produced by further metabolic engineering. Thus, the strategy of combined metabolic engineering and enzyme engineering allowed efficient bio-based one-step production of PLA and its copolymers. This strategy should be generally useful for developing other engineered organisms capable of producing various unnatural polymers by direct fermentation from renewable resources.
폴리유산 (polylactic acid, PLA)은 많은 바이오매스 유래 고분자들 중에서도 생분해성, 생체적합성, 구조적 안정성, 그리고 낮은 독성과 같은 뛰어난 물성으로 인해 석유 유래 플라스틱의 대체물로서 대두되고 있다. 그러나, 폴리유산은 현재 이단계 공정으로 합성된다. 우선, 미생물 발효를 통해 유산 (락트산, lactic acid)을 생산, 이를 정제, 그 후, 여러 가지 시약, 용매 및 촉매가 첨가되는 복잡한 공정의 화학적 중합반응에 의해 폴리유산이 합성된다. 또한, 폴리유산의 물성을 다양하게 개선하기 위해 폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydroxyalkanoates, PHAs)와 같은 다른 고분자들과의 공중합이나 혼합반응 등의 연구가 이루어지고 있다. 이러한 노력에도 불구하고, 공중합 반응에 사용되는 락톤계 모노머들의 가용성과 비용을 고려했을 때, 기존의 화학적 합성 방법은 효과적이지 않다.
이에, 폴리하이드록시알카노에이트의 생합성 시스템을 이용하여 폴리유산과 그의 공중합체들의 일단계 생산이 가능해졌다. 그러나, 외래 대사경로의 도입 및 조작만으로는 폴리유산 단일 중합체와 유산의 함량이 높은 공중합체의 생산이 효율적이지 않아, 이러한 고분자의 생합성을 강화하기 위해 시스템 수준으로 세포 내 대사흐름을 증가시킬 필요가 있었다. 따라서, 효소공학을 통한 고분자 합성 경로의 직접적 조작 및 강화 뿐 아니라, 논리적 접근으로 조작된 대사흐름을 바탕으로 다양한 폴리유산 공중합체를 보다 효율적으로 합성할 수 있는 기반을 마련하였다.
첫째, 폴리유산 단일 중합체와 유산의 함량이 높은 공중합체를 생산하기 위하여 대장균 세포 내 유산의 흐름을 논리적 조작으로 강화시키고 그 효과를 다양한 측면에서 확인하였다. 그 결과, 최초로 폴리유산 단일 중합체를 생합성할 수 있었다.
둘째, 폴리유산 고분자의 생산을 보다 더 증가시키기 위해, 논리적 접근으로 조작된 대장균 균주를 기반으로 인실리코 게놈 수준의 시뮬레이션을 이용한 대사 흐름 분석 기법을 이용하여 대사 흐름을 추가 조작한 결과, 폴리유산 단일중합체의 생산과 폴리유산 고분자 내 유산의 함량을 보다 더 증가시켰다.
셋째, 앞서 개발된 폴리유산 생산 균주와 이의 대사정보를 기반으로 대장균 대사경로를 폴리유산 고분자 생산에 유리하도록 재조작하여, 보다 효율적으로 폴리유산 고분자를 생산할 수 있었다.
넷째, 폴리유산 고분자의 중합반응에 있어 직접적으로 폴리유산 고분자를 합성하는 폴리하이드록시알카노에이트 중합효소를 개량하였다. 선행연구가 이루어진 슈도모나스 종 MBEL 6-19 균주의 폴리하이드록시알카노에이트 중합효소를 기반으로 동종성이 높은 같은 군 (type II)의 다양한 슈도모나스 균주들의 중합효소를 확보, 이를 폴리유산 고분자 생산을 위해 개량함으로써, 유산 중합효소를 다양화하였다.
다섯째, 본 연구에서 개발된 효소와 균주를 이용하여, 모델시스템 및 고분자로 생산된 3-하이드록시부티레이트 (3-hydroxybutyrate)와 유산의 공중합체 뿐 아니라, 그 외의 다양한 폴리유산 공중합체의 생산이 가능함을 확인하였고, 그 중에서도 특히, 바이오의학 및 재료 분야에서 널리 사용되고 있는 글리콜산 (glycolic acid)과 유산의 공중합체 [poly(lactate-$\It{co}$-glycolate), PLGA]가 추가 대사공학을 통해, 최초로 포도당으로부터 생산될 수 있었다.
본 연구에서 수행된 시스템 수준의 대사공학과 효소공학의 결합을 통해, 유산 함유 고분자의 효율적인 일단계 생산을 위한 유용한 기반기술을 마련하였고, 이를 토대로 재생가능한 자원으로부터 다른 비자연 고분자 (unnatural polymer)들을 생산할 수 있는 가능성을 열어주었다.
