The earth’s rotation results in daily environmental changes, such as light/dark and temperature. To deal with these changes better, a variety of organisms have evolved circadian clock system. The circadian rhythms are generated by cell-autonomous and endogenous clock system. The rhythm persists without time cues and can be tuned by the external time signal. Using UAS/GAL4 systems, we performed a genetic screen for circadian locomotor activities. Through this screen, we identified several candidates that showed long periods of behavior. In this study, we report on the analysis of one of the candidates, CG4857 that we named $\It{twenty-four}$ ($\It{twf}$, 4+8+5+7=24). Targeted expression of $\It{twf}$ by circadian specific GAL4 drivers resulted in a long period. Two strong hypomorphic $\It{twf}$ alleles as well as RNAi-mediated $\It{twf}$ knockdown in clock cells showed in weak but long periods. The complementation test between twf hypomorphs and deficiencies confirmed that mutations of $\It{twf}$ responsible for the circadian phenotypes. To reveal the underlying molecular mechanism, we examined the expression of circadian genes in the brain. As a result, dramatic reduction of PERIOD protein levels was observed in $\It{twf}$ hypomorphs. Restoring TWF expression in the ventral lateral neurons is sufficient to rescue behavioral rhythms and PER cycling. $\It{per}$ transgenes lacking the per promoter or lacking a domain important for PER degradation were influenced by $\It{twf}$. These results suggest the post-transcriptional function of $\It{twf}$. TWF was associated with per and tim transcripts and the poly(A)-binding protein (PABP), respectively. Furthermore, TWF was sedimented with polyribosomes in sucrose gradient. Using RNA tethering assay in S2 cells, we found that TWF activates reporter expression, which fused with $\It{per}$ 3’UTR. These findings suggest that twf is required for circadian locomotor activities and specifically activates PER expression in pace maker cells. We propose the function of $\It{twf}$ as a translational regulator of PER to sustain the circadian rhythm in $\It{Drosophila}$.
지구의 자전으로 인해 생기는 낮 밤과 온도의 변화는 생명체로 하여금 일주기성 생체 리듬을 진화 시키도록 하였다. 일주기성 생체 시계를 가진 생명체들은 환경의 변화를 예측함으로써 강한 자외선, 높은 온도, 건조함과 같은 위험요소에 대응할 수 있다. 생체 시계를 가진 모델 동물 하나인 초파리는 우화 시기와 활동성이 일주기성을 나타낸다.
본 연구에서는 4000여 개의 리포터 돌연변이체와 생체 시계 핵심 유전자 중 하나인 $\It{timeless}$의 프로모터를 가진 GAL4 드라이버를 교배시킨 후 활동 주기의 이상을 관찰하는 스크리닝을 수행하였다. 이를 통해 발굴된 주기가 길어지는 유전자 중의 하나인 CG4857은 기능이 알려져 있는 않은 새로운 유전자였다. 이 유전자를 $\It{twenty-four (twf)}$라 명명하고, 생체 시계 내에서의 기능을 밝히기 위한 연구들을 수행하였다. $\It{twf}$의 저발현 돌연변이체(hypomorph)들은 연속적인 어둠 내에서 활동의 주기성이 약화되며, 길어지는 양상을 보였다. 결실 돌연변이체와의 상보성 테스트와 TWF 발현의 회복에 의한 활동 주기의 주기성 회복 등을 통하여, $\It{twf}$가 일주기적 활동에 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다. $\It{twf}$의 저 발현 돌연변이체 뇌 내에서는 PERIOD(PER)와 TIMELESS(TIM) 의 단백질 발현이 줄어 들어 있음이 관찰되었다. 활동성에 중요하다고 알려진 PDF + 신경세포에서 각각의 단백질을 발현시켰을 때, PER만이 저 발현 돌연변이체의 비정상적인 활동 주기를 회복시킬 수 있었다. $\It{twf}$가 여러 종류의 $\It{per}$ 돌연변이체 내의 PER의 발현에 미치는 영향을 조사함으로써, $\It{per}$ 전사체가 만들어진 후 단백질로 번역되는 단계에서의 기능을 예측할 수 있었다. 또한 초파리 머리의 분리물을 면역침강법으로 분석한 결과 TWF가 poly(A)-binding 단백질과 결합하며, per, tim 전사체와 결합한다는 것을 밝혔다 밀도 구배관 실험을 통하여, TWF가 폴리솜과 결합하며, 단백질 번역 효율을 높여준다고 알려져 있는 poly(A)-binding 단백질과 비슷한 밀도 양상을 보인다는 것을 알 수 있었다. 초파리 세포 내에서 리포터 리보핵산에 TWF 단백질을 인위적으로 결합시킨 후 리포터의 발현을 조사하였다. TWF 단백질은 리포터 단백질의 발현을 촉진 시켰고, 밀도 구배관 실험 시 상대적으로 많은 리포터 전사체들이 폴리솜과 같은 밀도에 존재하게 하였다. 결과들을 종합해보면, $\It{twf}$ 유전자는 $\It{per}$ 전사체가 단백질로 번역되는 과정을 증진시킴으로써 초파리의 일주기적활동을 조절할 것으로 생각 되어진다.
